宏基因测序检出耶氏肺孢子菌的非HIV患者的临床分析

徐如意 曾丽云 陈辉 郑琳 於学婵 虞亦鸣 庄起东 陈众博 邓在春

[摘要] 目的 总结并分析支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）檢出低序列耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii，PJ）的非HIV患者的危险因素、临床特点、治疗及预后。方法 回顾性分析2018年5月至2022年6月在宁波大学附属第一医院因不明原因肺炎行气管镜检查且BALF-mNGS检出PJ的13例非HIV患者的临床资料。结果 13例患者中，危险因素以使用糖皮质激素最为常见，最常见的症状是咳嗽、咳痰，12例患者有血感染指标异常，影像学特点以两肺弥漫性病变、多发磨玻璃影为主。12例患者接受抗PJ治疗，其中11例患者在治疗期间病情好转，1例因重症感染治疗无效死亡；1例患者未接受抗PJ治疗，在经验性抗感染治疗后好转。结论 经BALF-mNGS检出PJ的非HIV患者临床特点不典型，结合mNGS结果与宿主因素综合判断，有助于早诊、早治，改善患者的预后。

[关键词] 非HIV患者；肺孢子菌肺炎；宏基因组二代测序；低序列

[中图分类号] R519      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.003

Clinical analysis of non-HIV patients with Pneumocystis jirovecii detected by metagenomic sequencing

XU Ruyi1， ZENG Liyun2， CHEN Hui1， ZHENG Lin3， YU Xuechan1， YU Yiming1， ZHUANG Qidong1， CHEN Zhongbo1， DENG Zaichun1

1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine， the First Affiliated Hospital of Ningbo University， Key Laboratory of Respiratory Disease of Ningbo， Ningbo 315010， Zhejiang， China; 2.Department of Technology， Hangzhou Matridx Biotechnology Co.， Ltd， Hangzhou 310030， Zhejiang， China; 3.Microbiology Department， the First Affiliated Hospital of Ningbo University， Ningbo 315010， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To summarize and analyze the risk factors， clinical characteristics， treatment， and prognosis of non-HIV patients with low-sequence Pneumocystis jirovecii （PJ） detected by metagenomic next-generation sequencing （mNGS） of bronchoalveolar lavage fluid （BALF）. Methods The clinical data of 13 non-HIV patients with PJ detected by BALF-mNGS who underwent bronchoscopy due to unexplained pneumonia in the First Affiliated Hospital of Ningbo University from May 2018 to June 2022 were retrospectively analyzed. Results Among the 13 patients， the use of glucocorticoids was the most common risk factor， the most common symptom was cough and expectoration， 12 patients had abnormal blood infection indicators， and the main imaging features were diffuse lesions in both lungs and multiple ground glass shadows. 12 patients received anti-PJ treatment， of which 11 patients were improved during treatment， and one patient died due to ineffective treatment of severe infection. One patient did not receive anti-PJ therapy and improved after empirical anti-infective therapy. Conclusion The clinical characteristics of non-HIV patients with PJ detected by BALF-mNGS are not typical. The combination of mNGS results and host factors is helpful for early diagnosis， treatment and improving the prognosis of patients.

[Key words] Non-HIV patients; Pneumocystis pneumonia; Metagenomic next-generation sequencing; Low sequence

耶氏肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia，PJP）是一种致命的机会性真菌感染，近年来，PJP在非HIV感染者中的发病率有所升高[1-2]。在非HIV感染者中，PJP的死亡率也在增加，HIV阴性的PJP患者的死亡率为25%～50%[3-6]。以往研究表明，在感染耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii，PJ）的患者中，与HIV阳性患者相比，HIV阴性患者的症状不典型，疾病进展更快，并发感染的风险更高，预后更差，且死亡率更高[7]。这就要求临床上对PJ应早检出、早治疗。作为一种检测手段，宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）无须事先根据临床表现来预测可能的病原体，其诊断肺部真菌感染性疾病的敏感性和特异性优于传统培养方法[8-9]。本研究对13例由mNGS检出PJ阳性的非HIV患者的临床资料进行回顾性分析和总结，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  资料

回顾性分析2018年5月至2022年6月于宁波大学附属第一医院住院治疗的13例经支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）-mNGS检出PJ阳性的非HIV患者。从住院患者信息中提取每位病例的基本信息、危险因素、临床特征、实验室检查结果和胸部CT表现，并收集患者的治疗方案及随访治疗效果。本研究经宁波大学附属第一医院伦理委员会批準（伦理审批号：伦审2023研第082RS号），所有研究对象均被充分告知检查内容及相关风险。

1.2  支气管肺泡灌洗液收集

患者在全身麻醉下，由专业医生进行支气管镜检查，支气管肺泡灌洗3次（每次20ml）。根据胸部CT显示的病灶位置确定灌洗区域。若双肺有弥漫性病变，则在右肺中叶进行灌洗，并立即密封两管3ml BALF，送至杭州杰毅生物技术有限公司用于mNGS检测[10-11]。

1.3  mNGS的操作步骤

取1.2ml磷酸缓冲盐溶液加入标本管，置于涡旋震荡仪震荡混匀10min。吸取1.2ml标本管中液体于2ml震荡管中。将震荡管置于生物样本匀质仪中，匀质9min，利用高效三维高速碰撞破碎细胞，对样品进行研磨、裂解、均质。取出震荡管放入离心机中，以12 000转/min离心3min，吸取上清液400μl至小体积基因组核酸提取或纯化试剂盒中，放入NGS master全自动建库仪进行核酸提取及文库构建。使用DNA降解和环化将双链DNA文库转化为单链环状DNA。最后在Illumina测序平台进行高通量测序[12-13]。

2  结果

2.1  患者的基本特征及患PJP的危险因素

共13例非HIV患者通过BALF-mNGS检测到PJ，男11例，女2例，年龄53～82岁；其中9例患者有两种或以上基础疾病，8例有全身糖皮质激素使用史，5例有糖尿病，4例有实体器官恶性肿瘤病史，3例有血液系统恶性肿瘤，2例有肝硬化病史，1例有肾脏疾病，1例无感染PJ的危险因素，见表1。

2.2  临床症状

在患病过程中，11例有咳嗽症状，8例出现劳力性呼吸困难，6例出现发热，4例出现乏力，1例有胸痛表现，见表2。

2.3  实验室检查及影像学特点

在患病过程中，4例患者出现白细胞计数升高，12例患者出现C反应蛋白升高，11例患者出现淋巴细胞计数下降，8例患者的乳酸脱氢酶水平升高。胸部CT提示多发磨玻璃影8例，渗出影4例，实变3例，胸腔积液2例。mNGS检出的PJ序列数从1至962不等，3例患者仅检出PJ，10例患者同时检出其他病原体，见表3。

2.4  治疗及效果

入院后，因呼吸道症状及肺部炎症，所有患者均接受经验性抗生素治疗。在BALF-mNGS检出PJ后，12例患者在原抗感染治疗方案基础上加用磺胺甲唑–甲氧苄啶（sulfamethoxazole-trimethoprim，SMZ-TMP）治疗，1例患者未接受针对PJ的治疗。抗PJ治疗后，11例患者症状好转，其中8例患者在复查胸部CT时观察到病灶吸收（典型胸部CT表现见图1）；1例患者基础状态差，有肺恶性肿瘤、2型糖尿病、脑梗死病史，因“咳嗽咳痰伴气促1周，加重1d”入院，虽在抗PJ治疗后患者症状曾一度好转，但后续因严重感染，经多种抗生素治疗后症状仍进一步恶化，出现呼吸衰竭、急性左心衰、肝功能异常等表现，住院期间因严重感染及多器官损伤经治疗无效后死亡。1例未接受抗PJ治疗的患者在莫西沙星治疗后症状明显好转，见表4。

3  讨论

PJP是一种致命的机会性肺部感染性疾病，在非HIV患者中，PJ常定植于肺部，当基础疾病加重或全身情况恶化时，PJ可由定植转为侵袭性感染，继而出现肺部病灶扩大及发热、咳嗽、呼吸困难等非特异性表现[1，5，14]。与HIV患者相比，非HIV患者感染PJ后症状更严重，疾病进展更快，呼吸衰竭比例更高，这使得非HIV患者感染PJ后面临更高的死亡风险[7]。

六胺银（gomori methenamine silver，GMS）染色检出PJ的特异性很高，有研究证明特异性达到100%，但敏感度低导致GMS染色在诊断PJP时非常容易漏诊[15-16]。目前，BALF-mNGS技术广泛用于PJ的检测，在诊断肺部感染性疾病时，敏感度高是mNGS的一个重要优势。研究显示，BALF-mNGS的敏感度、特异性均显著高于血清（1，3）-β-D-葡聚糖试验[17-18]。Jiang[19]等发现BALF-mNGS诊断PJP的敏感度明显高于GMS染色。

有研究表明，PJP患者易出现其他致病菌的合并感染，如巨细胞病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒1型、念珠菌及细环病毒[17， 19]。在本研究的13例患者中，有10例患者mNGS检出其他病原体的序列，以巨细胞病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒1型为主，这与之前的研究结果一致。由于PJP患者常有其他病原体的混合感染，mNGS因其诊断混合感染的优势，相比其他微生物学检查更适用于PJP的诊断。

过去，临床上主要根据mNGS检出病原菌的序列数判断是否需要治疗，但序列数并不能完全真实反映患者体内病原微生物的含量；在mNGS技术中，微生物读数会随着样本中宿主细胞浓度的增加而降低[20]。mNGS检出的PJ序列数变化很大（2～1 665 693）[21-24]。在本文回顾性研究的13例BALF-mNGS检出PJ的非HIV患者中，同样也观察到低序列数的PJ，最小序列数为1。由于PJ在自然界广泛存在并可能在呼吸道定植，故mNGS检出PJ并不等同于感染，但目前仍没有准确的阈值来判断BALF-mNGS检出的PJ是定植还是侵袭性感染[17]。对这些低序列数患者是否需要抗PJ治疗？首先，虽然PJ可定植于肺部，但临床上在免疫功能正常或既往没有肺部疾病的患者中很少见到PJ感染。本研究纳入的患者中，免疫抑制状态及肺部基础疾病十分常见，这一特点与之前报道的PJ感染病例大致相同[1， 4， 25-27]。一项关于mNGS诊断疑似感染病灶的研究数据显示，对免疫正常患者的样本进行mNGS检测时，很少报告PJ阳性[24]。其次，雖然定植在肺部的PJ有时不直接产生症状，但仍可参与激活炎症反应，造成肺部损伤，甚至导致其他肺部疾病的恶化[28]。最后，对免疫功能低下的非HIV患者，PJ定植转为侵袭感染时，疾病进展快，预后差[3， 7]。所以笔者认为对有肺部基础疾病或免疫损伤危险因素的非HIV患者，即使检出的PJ序列数低，预防性抗PJ治疗也非常重要。

综上所述，BALF-mNGS检出PJ阳性的非HIV患者临床特点不典型，mNGS可帮助检出PJ，并有助于发现混合感染的病原体。对mNGS检出PJ阳性的低序列患者，若有肺部基础疾病或免疫功能受损等危险因素，应尽早开始抗PJ治疗，以期改善患者的预后。

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[12] MARAN M I J， DAVIS G D. Benefits of merging paired-end reads before pre-processing environmental metagenomics data [J]. Mar Genomics， 2022， 61： 100914.

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