朝阳地区葡萄灰霉病对3 种药剂的抗药性分析

董莉，董文阁，刘晓伟，刘念

（辽宁省旱地农林研究所，辽宁 朝阳 122000）

葡萄灰霉病是葡萄生产中的主要病害之一，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染引起[1]。该病害主要侵染葡萄叶和果实，葡萄一旦染病后病程发展迅速，在适宜发病的环境条件下几天后即发生落粒和果实软腐，然后果皮表面产生灰色至浅黄色菌丝和分生孢子，较难控制，最终影响葡萄产量、品质[2]。葡萄灰霉病主要通过空气传播，田间温度、湿度条件适宜即可发生，该病害目前防治仍以化学防治为主。随着药剂使用时间的增长，抗药性问题开始屡见报道。纪明山等[3]报道了辽宁省采集到的番茄灰霉病菌对腐霉利的抗性频率达到70%以上，对嘧霉胺的抗性频率达到100%，而2006 年当地对嘧霉胺的抗性频率仅为17.14%[4]。郝永娟等[5]于2015 年报道了天津地区番茄灰霉病菌对乙霉威的抗性频率为42.86%。

朝阳地区具有葡萄栽培适宜的光热等条件，无霜期短、雨雪天气少而日照充足、昼夜温差大、空气湿度低、土壤适宜，有利于生产优质的鲜食葡萄，栽培方式以露地栽培、温室促早栽培和冷棚秋延栽培为主，每年4—12 月持续供应鲜食葡萄。朝阳地区作为环渤海设施农业种植区的重要组成，有着庞大的设施资源，葡萄种植是当地平衡种植结构、降低设施蔬菜大规模种植风险的有效途径。考虑到腐霉利、乙霉威、嘧霉胺是灰霉病防治的主要用药，3种药剂在朝阳地区的抗性情况并不明确，为了更好地防治该病害，科学选择防治药剂，该文对3 种药剂进行了抗药性频率和抗药性类型分析，为当地灰霉病化学防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株。2022 年9—10 月，在朝阳市6 个县市区葡萄种植园收集葡萄果实，采用单菌落分离法在实验室内进行病原菌分离，获得菌样123 份，放于冻存管内，4℃冰箱保存。

1.1.2 供试药剂。葡萄糖；琼脂；K2HPO4；MgSO4·7H2O；HCl；KCl；FeSO4·7H2O；L-天冬酰胺；50%腐霉利可湿性粉剂（日本住友化学株式会社）；80%嘧霉胺水分散粒剂（山东绿丰农药有限公司）；99.1%乙霉威原药（购于沈阳化工研究院）。

腐霉利和嘧霉胺溶于无菌水内，配置成1 000 μg/L母液；乙霉威溶于适量丙酮后加入无菌水，配置成1 000 ug/L母液。药液保存在棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存待用。

1.1.3 供试仪器。电子天平、分析天平、灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、冰箱；镊子、打孔器、挑针、培养皿、棕色试剂瓶、锥形瓶、冻存管、微波炉、电磁炉、封口膜等实验室常用耗材。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备。

（1）PDA 培养基：将马铃薯洗净去皮，取200 g 切成小方块，加入去离子水煮沸20~30 min，4 层纱布过滤，待滤液降温后，加入称量好的17~20 g 琼脂粉、20 g 葡萄糖，加水定容至1 000 mL，重新倒入锅中煮沸融化，然后分装到锥形瓶中，灭菌锅121℃，灭菌30 min；

（2）asp 培养基：K2HPO4及MgSO4·7H2O 各1 g 分别溶于30 mL 去离子水中，将两者混合后用10 mol/L HCl 溶解沉淀物，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，L-天冬酰胺2 g，葡萄糖22 g，琼脂18~20 g，加去离子水至1 L，分装到锥形瓶中，灭菌锅121℃，灭菌30 min[6]。

1.2.2 病样采集和分离。在葡萄种植区购买葡萄果穗，装入未使用过的自封袋内，密封带回。25℃放置5~7 d，待病果长出较多孢子后，用灭菌牙签蘸取孢子，采用划线法在水琼脂培养基上培养24 h 获得单菌落，转移至PDA 培养基上培养3 d，切取适当大小菌块放于冻存管内，封口膜封口，放于4℃冰箱保存待用。

1.2.3 葡萄灰霉病菌对腐霉利、嘧霉胺、乙霉威抗药性测定。采用最低抑制浓度法（MIC）开展对腐霉利、嘧霉胺、乙霉威3 种药剂的抗药性频率检测，鉴别浓度分别为腐霉利5 μg/mL，嘧霉胺1 μg/mL，乙霉威1μg/mL[7]。将培养基降温至60℃左右时，加入待测药剂，倒入9 mm 培养皿内制成含药平板，每皿倒入培养基7~10 mL。将待测菌样在PDA 培养基上培养3 d 后，用5 mm 打孔器打取菌饼，放入含药平板上，每皿3 个，3 d 后观察生长情况。在鉴别浓度下，能够正常生长的为抗性菌株，不能正常生长的为敏感菌株。计算抗性菌株频率：嘧霉胺用L-asp 培养基，腐霉利、乙霉威用PDA 培养基。

抗性频率（%）=抗性菌株数/总菌株数×100

2 结果与分析

2.1 葡萄灰霉病对腐霉利的抗性

对采集到的123 株葡萄灰霉病菌开展腐霉利抗性频率试验（表1），结果显示，朝阳地区葡萄灰霉病对腐霉利的抗性菌株数为103 株，抗性频率为83.74%，抗性频率最低为朝阳县的57.14%，最高为龙城区的95.65%。

表1 葡萄灰霉病菌对腐霉利抗性频率检测

2.2 葡萄灰霉病对乙霉威的抗性

从表2 可以看出，采集到的葡萄灰霉病菌株对乙霉威的抗性频率为57.72%，抗性菌株数71 株，不同地区菌株的抗性频率不同，其中喀左县抗性频率最低，建平县抗性频率最高。

表2 葡萄灰霉病菌对乙霉威抗性频率检测

2.3 葡萄灰霉病对嘧霉胺的抗性

从表3 可以看出，123 株葡萄灰霉病菌对嘧霉胺的抗性菌株数为116 株，抗性频率为94.31%，虽然不同地区灰霉病菌抗性频率不同，但最低抗性频率也达到92.11%，其中建平县和朝阳县采集的菌株对嘧霉胺全部表现抗药性。

表3 葡萄灰霉病菌对嘧霉胺抗性频率检测

2.4 葡萄灰霉病对3 种药剂的抗性类型

从表4 可以看出，采集的123 株葡萄灰霉病菌株对腐霉利、乙霉威、嘧霉胺的抗药性类型共有6 种：ProSDieSPyrR、ProRDieSPyrR、 ProRDieRPyrR、 ProSDieRPyrR、 ProRDieSPyrS、ProRDieRPyrS，其中表现三重抗性菌株占比47.97%，双重抗性菌株占比41.47%（RSR 类型31.71%，SRR 类型8.13%，RRS 类型1.63%），单一抗性类型占比8.94%（SSR 类型6.50%，RSS 类型2.44%）。

表4 朝阳地区葡萄灰霉病菌对3 种杀菌剂的抗性类型及分布

3 结论与讨论

腐霉利、乙霉威、嘧霉胺是朝阳市葡萄灰霉病防治使用多年的药剂，多年的药剂选择压力下，病菌极易产生抗药性，及时了解灰霉病菌抗性发展问题，对当地葡萄灰霉病防治具有重要的指导意义。该试验结果表明，朝阳市葡萄灰霉病对嘧霉胺已产生普遍抗药性，对腐霉利的抗药性也达到了83.74%，乙霉威的抗性频率稍低，但也达到57.72%。被检测的123 株葡萄灰霉病菌株表现了6 种抗性类型（RRR、RSR、SRR、RRS、SSR、RSS），其中对3 种被测药剂表现三重抗药性的病菌占比最高，达到47.97%，双重抗性菌株达到41.47%，说明朝阳地区葡萄灰霉病菌对3 种药剂的抗药性发生较为普遍。为更好地防治葡萄灰霉病，保障葡萄产量和效益，建议生产上应减少嘧霉胺、腐霉利的使用次数，使用其他作用方式的药剂进行代替，同时注意轮换用药，不得随意加大药剂使用浓度。