布鲁菌病疫苗的研究进展※

梁 晨,魏 伟,梁秀文,德恩金

(1.内蒙古自治区呼伦贝尔市人民医院,内蒙古 呼伦贝尔 021008;

2.内蒙古自治区呼伦贝尔市疾病预防控制中心,内蒙古 呼伦贝尔 021008)

布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的人兽共患传染病。布鲁菌为革兰阴性胞内寄生菌,以羊种布鲁菌、牛种布鲁菌和猪种布鲁菌较为常见[1]。人感染布鲁菌的临床表现多样,可见发热、多汗、乏力、关节肌肉疼痛等症状,治疗不当或治疗不及时可转为慢性,导致疾病迁延不愈。家畜感染布鲁菌可出现流产、不孕、繁殖成活率低等,使家畜数量明显减少,严重制约畜牧业发展[2]。疫苗接种是防治布鲁菌病的主要手段,早期以灭活疫苗为主,后期主要选用免疫效力更好的减毒活疫苗,其中用于家畜的疫苗包括S19、Rev.1、S2、M5和RB51等,用于人类的疫苗包括104M 和19-BA 等,然而有些疫苗存在一定缺陷,限制其广泛应用[3]。随着对布鲁菌致病机制研究的深入,以及相关分子生物学技术的发展,新型疫苗、基因工程疫苗取得了一定进展,现简述如下。

1 传统布鲁菌疫苗

目前,临床常用的动物布鲁菌疫苗有S19、Rev.1、S2、M5和RB51,均为减毒活疫苗,为控制布鲁菌病疫情、减少畜牧业经济损失发挥着重要作用[4]。布鲁菌减毒活疫苗通过筛选毒力较低的布鲁菌分离株或分离强毒株传代获得,与灭活疫苗相比,布鲁菌减毒活疫苗可激发动物机体的细胞免疫应答,具有免疫保护作用更持久、接种途径多样、成本低廉等优势[5]。

1.1 牛种布鲁菌S19疫苗 S19疫苗是一种广泛应用于奶牛布鲁菌病防控的疫苗,是牛种布鲁菌19的全菌制剂,被印度、阿根廷和巴西等许多国家参考使用,于1958年被引入中国[6]。S19疫苗最初是20世纪初从一头娟姗牛的乳汁中分离出的一种毒性菌株,在室温下自然衰减1年获得的光滑型突变体[7]。目前临床使用的S19疫苗是美国科学家挑选出来的一种赤藓糖醇(Ery)敏感的S19菌株。Ery基因包含4个开放阅读框:EryA、EryB、EryC和EryD。S19存在702bp的核苷酸序列缺失,从而影响到EryC(bab2_0370)和EryD(bab2_0369)的编码区域,从而使S19对Ery敏感[8]。S19是光滑的布鲁菌菌株表型,其脂多糖含有O-多糖,可以持续刺激动物产生抗脂多糖抗体,干扰已产生免疫动物和自然感染动物之间的常规血清学检测,此外可导致怀孕奶牛流产,引起公牛持续的睾丸炎[9]。S19的免疫效果取决于接种动物的年龄、接种途径和剂量、感染途径等因素。改进和保持S19疫苗良好的免疫原性和遗传稳定性,有可能通过添加标记基因提高鉴别诊断的效率和简便性。目前,可以使用多个候选对象作为标记基因,如BP26和p39基因[10]。此外,S19对人类具有一定程度的致病力。近年来,世界各地均有报告指出,在S19疫苗生产或接种过程中造成人员感染布鲁菌[8]。未来可利用缺失的702bp片段区分S19和其他野毒株,并应用重组DNA 技术开发出更好的、安全性更高的S19疫苗[11]。我国目前使用A19疫苗替代S19,A19毒力介于S2和M5疫苗之间,对牛的免疫效果较好。

1.2 羊种布鲁菌Rev.1疫苗 Rev.1疫苗是一种链霉素耐药的光滑型羊种布鲁菌菌株。20世纪60年代在希腊、约旦、塔吉克斯坦、蒙古和西班牙等国用于预防动物布鲁菌病。实验证实羊接种Rev.1 疫苗后产生的免疫应答效果与S19接近,但保护力较强[12],能有效降低母羊流产的概率。该疫苗通过黏膜产生免疫,主要在头颅淋巴结内进行复制,对常规血清学诊断影响较小。由于Rev.1带有链霉素耐药性,所以使用链霉素和四环素治疗布鲁菌病的效果不佳,应引起注意。Rev.1疫苗的缺点是在某些特定条件下可完全恢复Rev.1菌株毒性而导致怀孕牲畜流产,且Rev.1菌株在动物体内具有较长的存活期,可通过分泌物和乳汁传播。Rev.1疫苗的上述缺点可以通过减少剂量来克服,但在羊布鲁菌已被根除的国家禁止使用[7]。

1.3 羊种布鲁菌M5疫苗 M5疫苗是1962年由哈尔滨兽医研究所研制,通过弱化强毒株M28得到的弱毒株。应用M5疫苗不使用佐剂,其免疫途径为气雾免疫,剂量为5×109cfu。1970年我国首次大规模使用M5疫苗对绵羊和山羊进行接种实验,效果显著,接种动物产生较好的免疫保护力。与M28疫苗和M16相比,M5疫苗的毒力明显降低[2,13]。M5疫苗的研发对我国动物布鲁菌病的防控发挥了积极作用。然而M5疫苗毒力强并且可以引起高血清反应,为国产疫苗中毒力最强的菌株,且较不稳定,基因组突变通常发生在培养阶段,另外无法区分感染或接种后产生的免疫应答。鉴于其存在以上缺点,国内布鲁菌病疫区很少使用M5疫苗,2017年我国原农业部已下发文件停止使用M5疫苗。

1.4 猪种布鲁菌S2疫苗 S2疫苗是1952年中国兽医药品监察所在猪流产胎儿体内分离得到的猪种布鲁菌毒株,经培养基连续传代后的光滑型弱毒株。应用S2疫苗不使用佐剂,通过口服方式,可有效预防猪布鲁菌感染。对于牛、绵羊、山羊等易感家畜,口服S2疫苗也能提供满意的防护效果。与S19和Rev.1相比,S2疫苗具有较低的残留毒性、疫苗生产成本低且可以口服免疫等优点。然而研究显示,在大型动物中,S2的免疫保护力低于S19和Rev.1,刺激机体产生抗体持续时间较短。

1.5 牛种布鲁菌RB51疫苗 RB51疫苗是牛种布鲁菌2308 的一个自发突变株,该疫苗未使用佐剂。RB51 为粗糙型疫苗株,菌株中编码糖基转移酶的whoA 基因被IS711插入序列破坏,从而表现为粗糙型,用RB51免疫的动物易与自然感染区分[14]。RB51菌株比较稳定,与S19相比毒力弱,美国、墨西哥等国家用RB51疫苗替代S19疫苗用于奶牛布鲁菌病的免疫。RB51具有利福平抗性,易通过选择性培养基进行分离鉴定,但不利于布鲁菌病的常规治疗。RB51可感染人类,多因针刺损伤意外暴露引起[15]。

2 基因工程疫苗

随着同源重组技术的发展,一些基因工程减毒菌株逐渐进入大众视野。通过干扰参与脂多糖(LPS)生物合成途径的必需基因如per、pgm、wboA、wbkA 等得到粗糙型突变体,其优点在于不干扰常规血常规诊断而且毒力明显降低。其他突变体如purl、purd、pure、baca、hemh、virb或pgk基因的破坏后得到了较好免疫保护力[2,7,16]。尽管前期试验结果较好,但是这些突变体在动物身上大规模的试验还有待进行。

2.1 亚单位疫苗 亚单位疫苗的合成原料为重组布鲁菌属蛋白,疫苗的佐剂为完全氟化物佐剂或不完全氟化物[7,17]。有学者通过研究小鼠模型发现,许多布鲁菌膜和细胞溶质蛋白可起到保护性抗原的作用,包括L7/L12核糖体蛋白、外膜蛋白(Omp)2b、Omp31、Omp16、Omp19、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、22.9-kda蛋白、二氧四氢蝶啶合成酶及核苷二磷酸。然而与S19疫苗相比,部分重组蛋白在体内的免疫效果较差[18]。尽管Omp16和Omp19自身具有佐剂特性,但大多数重组蛋白需要协同使用佐剂以增强免疫反应。使用佐剂往往会引起不良反应,如注射部位的局部炎症、肉芽肿的形成或无菌性脓肿。因此,今后应更加广泛地致力于开发新的重组蛋白疫苗,由多个布鲁菌抗原组成,而且具有自身佐剂特性。

2.2 DNA 疫苗 DNA 疫苗即用表达特定抗原基因的质粒进行疫苗接种,已成为开发布鲁菌病疫苗的新方向。这些疫苗含有编码布鲁菌属基因的重组质粒,无须佐剂。DNA 疫苗可编码以下基因:L7/L12,BLS、BCSP31、Cu/Zn-SOD、Omp16、P39 和Bab1-0278[9,19]。有两种方法可以提高DNA 疫苗或使免疫反应最大化。一种方法是DNA 疫苗中表达多种抗原,另一种方法是将细胞因子作为佐剂在DNA 疫苗中共同表达,以提高免疫应答。尽管已有研究通过动物实验证明大多数DNA 疫苗有很好的免疫效果,但在自然宿主中还需进一步的研究[20]。

3 新型疫苗

3.1 布鲁菌菌壳疫苗 布鲁菌壳疫苗通过表达裂解基因E导致细胞壁形成跨膜通道,从而引起菌体内容物外流而形成菌壳[21]。疫苗的合成为布鲁菌属的全有机体,不含细胞质成分,也无需添加佐剂。研究发现与灭活细菌相比,猪布鲁菌S2菌壳疫苗能显著提高免疫球蛋白G 和T 细胞应答的产生[22]。这种疫苗的缺陷比较明显,如抗生素抗性基因在野生布鲁菌中的水平转移困难等。

3.2 纳米颗粒疫苗 纳米颗粒疫苗是布鲁菌属抗原,通过疫苗抗原在纳米载体内或装饰在其表面压缩制成,常将脂多糖作为疫苗佐剂。与未结合抗原相比,纳米载体提供了一种合适的抗原给药途径,增强了细胞摄取,从而提高机体免疫效果[5,23]。此外,纳米载体可以作为佐剂在淋巴器官中产生免疫反应。纳米颗粒疫苗的抗原主要来源于布鲁菌Omp(19、25、31)、RL7/L12核糖体蛋白、LPS或细胞溶质蛋白,可用于布鲁菌病疫苗接种[24]。

3.3 通过逆向疫苗学方法确定候选疫苗 人用布鲁菌疫苗研制困难的主要原因可能在于布鲁菌存在多个种型,且保护性抗原谱复杂,单一抗原很难起到完全保护作用。随着组学及生物信息学的发展,逆向疫苗学逐渐成为研制新型疫苗的重要方法。逆向疫苗学(RV)以组学和生物信息学为基础进行抗原预测,并随后对预测的候选抗原进行验证评价,进而获得有效的保护性抗原用于新型疫苗研制。RV 方法是基于基因组数据研究而成,一般分3个步骤:①通过计算工具和在线数据库选择基因组分析以确定可能诱导免疫反应的免疫原表位;②合成或生产相关基因克隆、抗原肽或蛋白质;③在实验动物模型中检测重组抗原的免疫原性和保护作用[25]。虽然研究人员在不同的实验条件下发现了相应的布鲁菌基因表达谱,但是如何使用这些基因设计疫苗仍然是目前面临的一个挑战。

4 小结

疫苗是布鲁菌病预防和控制的关键策略,目前仍有部分国家人畜间布鲁菌病流行严重,未来期待更多国家的科研学者投入到布鲁菌病疫苗的研制中,从而减少布鲁菌病对人类、牲畜的危害。