依托咪酯对脂多糖诱导人气道平滑肌细胞炎性损伤的改善作用及其机制

张芸，袁风雷，袁若琳，李钊

华北医疗健康集团峰峰总医院麻醉科，河北 邯郸 056000

脂多糖（LPS）是内毒素的有效成分，是一种多糖、脂质和蛋白质的复合物，能够介导多种细胞、组织的损伤，是机体炎症反应的重要诱因。研究［1-2］显示，LPS可触发气道炎症，它通过降低肺泡毛细血管屏障功能，增加肺血管通透性以及促进白细胞浸入肺泡间隙，从而引起肺损伤。LPS可诱导炎症因子如白细胞介素（IL）-6、IL-8和肿瘤坏死因子（TNF）-α释放到局部肺组织和血液循环中，导致炎症反应的增强，这也是引起呼吸功能下降的呼吸道疾病的主要诱因，急性肺损伤的大鼠模型、急性肺损伤的细胞模型均是由LPS诱导形成的［3-4］。有丝分裂原激活的转化生长因子（TGF）-β1参与炎症的发生过程，可调节起关键作用的各种基因的表达，若TGF-β1激活与Smad家族蛋白3（Smad3）结合，会导致炎症细胞因子如IL-6、TNF-α的表达升高［5-6］。依托咪酯是一种新型选择性抗胆碱药，是一种常用的麻醉药物，可降低乙酰胆碱活性，从而发挥镇静作用［7］。依托咪酯的抗炎活性已在药理学研究中被证明。研究［8-9］发现，依托咪酯对溃疡性结肠炎、肺炎均有明显的抑制作用，可有效阻止溃疡性结肠炎和肺炎的疾病进展。然而，依托咪酯对呼吸道炎症疾病的抗炎作用机制尚未得到充分研究。2022年12月—2023年1月，我们观察了依托咪酯对LPS诱导人气道平滑肌细胞（ASMCs）炎性损伤的改善作用，并探讨其机制，以期为呼吸系统炎症疾病的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人ASMCs购自武汉菲恩生物科技有限公司。依托咪酯（原料药，纯度99.86%）购自深圳市民康源生物科技有限公司；胎牛血清、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡检测试剂盒、IL-2、IL-6、TNF-α酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒、反转录试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒均购自广州博辉生物科技有限公司；DMEM培养基、LPS、四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂盒、TRIzol试剂、PCR试剂盒、蛋白裂解液、ECL试剂均购自昆明亚灵生物科技有限公司；兔源TGF-β1、Smad3、GAPDH一抗、羊抗兔二抗均购自武汉菲越生物科技有限公司。MCO-15AC型CO2培养箱、CMax Plus型酶标仪、iQue 3型流式细胞仪均购自常州祥泰生物技术有限公司；Esan-Gene 696型荧光定量PCR仪、OmegaLum G型凝胶成像系统均购自南京北鱼生物科技有限公司。

1.2 细胞分组及LPS、依托咪酯给予 于5%CO2、37 ℃的培养环境在含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中培养ASMCs，每天更换培养液，在细胞覆盖率达到90%左右时使用胰蛋白酶消化、传代。选对数生长期的ASMCs接种于96孔板上（1×105个/孔），并分为对照组、LPS组［10］、依托咪酯低浓度组、依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组［11］。对照组常规培养ASMCs；LPS组在含ASMCs的培养基中加入500 ng/mL的LPS［10］；依托咪酯低浓度组、依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组在含ASMCs的培养基中加入500 ng/mL的LPS后，再分别加入5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL的依托咪酯［11］。各组设8个平行样，继续培养72 h。

1.3 各组细胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α检测 采用ELISA法。取各组细胞以3×104个/孔接种于24孔板上，弃培养基，收集细胞，磷酸盐缓冲液冲洗2次，按ELISA试剂盒说明书操作方法及步骤，检测各组细胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α。

1.4 各组细胞存活率、凋亡率测算

1.4.1 各组细胞存活率测算 采用MTT法。取各组细胞以5×104个/孔的密度接种于96孔板上，加入MTT溶液，CO2培养箱中继续培养4 h，吸去培养基，加入二甲基亚砜，振荡15 min，用酶标仪检测样本490 nm处的吸光度值（OD490值），计算各组细胞存活率。细胞存活率（%）=各组OD490值/对照组OD490值×100%。

1.4.2 各组细胞凋亡率测算 采用流式细胞法。取各组细胞重悬为1×105个/mL，加入Annexin VFITC和PI各8 µL，避光孵育15 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.5 各组细胞中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白检测

1.5.1 各组细胞中TGF-β1、Smad3 mRNA检测采用荧光定量PCR法。取各组细胞，使用TRIzol试剂分离总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，以U6为内参，荧光定量PCR法检测各组细胞中TGF-β1、Smad3 mRNA，引物由武汉琼格生物科技有限公司设计合成，引物序列如下：TGF-β1正向引物为5'-ATCGCGCCATGTTAACAACT-3'，反向引物为5'-TGGAAAGTCGCCACCGCGTG-3'；Smad3正向引物为5'-GTCTACTGAAGAGTAGTTAAC-3'，反向引物为5'-AATCCACATTCCCATCCATTG-3'；U6正向引物为5'-GCTCGAGTCCTCACATGCTCG-3'，反向引物为5'-TGATAGTAATCAGTCACTAGT-3'。反应条件及环境的配置参照PCR试剂盒说明书，以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.5.2 各组细胞中TGF-β1、Smad3蛋白检测 采用蛋白印迹法。取各组细胞，蛋白裂解液裂解，BCA试剂盒定量总蛋白，电泳分离各组中等量的蛋白质后转膜，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，加入稀释好的兔源TGF-β1（1：600）、Smad3（1：700）、GAPDH（1：1000）一抗，4 ℃下孵育过夜，加入羊抗兔二抗（1：1400），室温下孵育1 h，ECL试剂显色，采用Image J软件检测蛋白灰度值。目的蛋白相对表达量为目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS26.0统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比较 各组细胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比较见表1。由表1可知，与对照组相比，LPS组、依托咪酯低浓度组、依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组细胞中IL-2、IL-6、TNF-α水平均升高（P均＜0.05）；与LPS组相比，依托咪酯低浓度组、依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组细胞中IL-2、IL-6、TNF-α水平均降低（P均＜0.05），且依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组低于依托咪酯低浓度组（P均＜0.05），依托咪酯高浓度组低于依托咪酯中浓度组（P＜0.05）。

表1 各组细胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

表1 各组细胞中炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与LPS组相比，bP＜0.05；与依托咪酯低浓度组相比，cP＜0.05；与依托咪酯中浓度组相比，dP＜0.05。

组别依托咪酯低浓度组依托咪酯中浓度组依托咪酯高浓度组LPS组对照组IL-239.56 ± 5.11ab 28.79 ± 4.86abc 17.78 ± 2.77abcd 52.68 ± 5.86a 6.68 ± 1.65 IL-6104.76 ± 15.44ab 83.85 ± 12.86abc 65.85 ± 9.06abcd 127.68 ± 19.90a 41.75 ± 7.96 TNF-α 228.05 ± 27.87ab 195.69 ± 24.75abc 160.54 ± 19.58abcd 268.47 ± 29.16a 125.58 ± 17.86

2.2 各组细胞存活率、凋亡率比较 对照组、LPS组、依托咪酯低浓度组、依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组细胞存活率分别为100.00%、40.08% ±6.04%、52.87% ± 6.21%、66.48% ± 7.10%、81.26% ± 9.54%，组间相比，P均＜0.05。对照组、LPS组、依托咪酯低浓度组、依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组细胞凋亡率分别为4.40% ± 1.09%、25.16% ± 5.07%、19.77% ± 4.03%、14.71% ±2.25%、10.05% ± 2.05%，组间相比，P均＜0.05。

2.3 各组细胞中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白相对表达量比较 各组细胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相对表达量比较见表2。由表2可知，与对照组相比，LPS组、依托咪酯低浓度组、依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组细胞中TGF-β1 mRNA和蛋白相对表达量、Smad3 mRNA和蛋白相对表达量均升高（P均＜0.05）；与LPS组相比，依托咪酯低浓度组、依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组细胞中TGF-β1 mRNA和蛋白相对表达量、Smad3 mRNA和蛋白相对表达量均降低（P均＜0.05），且依托咪酯中浓度组、依托咪酯高浓度组低于依托咪酯低浓度组（P均＜0.05），依托咪酯高浓度组低于依托咪酯中浓度组（P＜0.05）。

表2 各组细胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相对表达量比较（±s）

表2 各组细胞中TGF-β1、Smad3 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与LPS组相比，bP＜0.05；与依托咪酯低浓度组相比，cP＜0.05；与依托咪酯中浓度组相比，dP＜0.05。

组别依托咪酯低浓度组依托咪酯中浓度组依托咪酯高浓度组LPS组对照组TGF-β1 mRNA 2.18 ± 0.41ab 1.78 ± 0.26abc 1.46 ± 0.21abcd 2.67 ± 0.55a 1.00 ± 0.00蛋白0.57 ± 0.12ab 0.40 ± 0.09abc 0.27 ± 0.05abcd 0.85 ± 0.18a 0.15 ± 0.02 Smad3 mRNA 2.05 ± 0.36ab 1.72 ± 0.31abc 1.33 ± 0.27abcd 2.55 ± 0.54a 1.00 ± 0.00蛋白0.90 ± 0.19ab 0.65 ± 0.15abc 0.48 ± 0.07abcd 1.08 ± 0.23a 0.29 ± 0.06

3 讨论

LPS是内毒素的有效成分，是一种多糖、脂质和蛋白质的复合物，能够介导多种细胞、组织的损伤，是机体炎症反应的重要诱因，同时其能干预气道上皮细胞分泌炎症因子，这些炎症因子能够参与机体的炎症反应过程和免疫应答过程［12-14］。依托咪酯是一种小分子量的化合物，也是一种常用的麻醉药物，起效快，同时有镇静和催眠的作用，其被证明可有效保护器官免受急性损伤，例如缺血和再灌注引起的心脏损伤以及动物急性肺损伤［15-16］。这些保护作用部分归因于其抗炎功能，依托咪酯已被证明可减轻急性肺损伤小鼠的肺组织炎性浸润和病理损伤［17］。然而，依托咪酯的抗炎作用的细胞和分子机制尚不完全清楚。本研究使用LPS处理ASMCs，结果发现，LPS处理的ASMCs存活率显著降低，凋亡率、IL-2、IL-6、TNF-α水平显著升高。在LPS处理的ASMCs培养基中加入依托咪酯后，可以观察到ASMCs存活率显著升高，凋亡率、IL-2、IL-6、TNF-α水平显著降低，且呈现浓度依赖性，与景建闯等［17］研究结果一致。本研究结果表明，LPS诱导的ASMCs发生炎性损伤，导致ASMCs存活减少，凋亡细胞数目增多，而依托咪酯能减轻LPS诱导的ASMCs炎性损伤，减少因炎性损伤导致的细胞凋亡，提高ASMCs存活率。

TGF-β1/Smad3是与气道重塑和脂质代谢过程密切相关的信号通路，TGF-β1在肝脏中含量较高，能够参与细胞的增殖、凋亡、分化等生物学行为［18-19］。Smad3是TGF-β1的下游信号分子，TGF-β1与其受体结合后能激活Smad3，调节相关细胞因子的表达，TGF-β1/Smad3信号通路也在炎症反应和多种器官纤维化的发展中起着重要作用［20-21］。FENG等［22］研究表明，地塞米松能够抑制TGF-β1/Smad3信号通路拮抗气道重塑。GUAN等［23］研究发现，人参皂苷Rg1能降低TGF-β1/Smad3信号通路活性，从而改善香烟烟雾诱导的大鼠气道重塑和肺功能。WU等［24］报道，细颗粒物能够激活TGF-β1/Smad3信号通路促使哮喘大鼠病情加重，从而导致气道纤维化。本研究发现，LPS处理的ASMCs中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白水平显著升高，在LPS处理的ASMCs培养基中加入依托咪酯后，ASMCs中TGF-β1、Smad3 mRNA和蛋白水平显著降低，且依托咪酯浓度越高，降低效果越明显。结合FENG和GUAN等［22-23］的研究，我们推测，抑制TGF-β1/Smad3信号通路能改善大鼠气道重塑，可能是因为减轻了大鼠ASMCs的炎性损伤，降低了ASMCs的凋亡率；而依托咪酯能抑制LPS诱导的ASMCs炎性损伤和凋亡，其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路的激活有关。

综上所述，5 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL的依托咪酯对LPS诱导人ASMCs炎性损伤均具有改善作用，可升高细胞存活率、降低细胞凋亡率，且20 µg/mL依托咪酯的的改善作用最强。依托咪酯对LPS诱导人ASMCs炎性损伤的改善作用机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路的激活有关。但本研究仅探讨了依托咪酯通过TGF-β1/Smad3信号通路对LPS诱导的ASMCs炎性损伤的抑制作用，依托咪酯能否通过其他信号通路抑制LPS诱导的ASMCs炎性损伤，有待深入研究。