中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子与神经系统疾病研究进展#

李仟 巫瑶 万莉红△

（1.基础医学2018 级，四川大学华西基础医学与法医学院，四川 成都 610041；2.四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室，四川 成都 610041）

中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子（Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）是一种进化保守的内质网应激相关蛋白[1]，在无脊椎动物和脊椎动物脑中广泛表达[2]。MANF 早期又被称为富含精氨酸的肿瘤早期突变基因（Arginine-rich,mutated in early stage tumors，ARMET），于2003 年被Petrova 等人从大鼠腹侧中脑Ⅰ型星形胶质细胞培养基中分离得到，因被证实缺少N 端的精氨酸序列，因此该蛋白后来被命名为MANF[3]。

神经营养因子（Neurotrophic factors，NTFs）是一类由神经支配的组织和星形胶质细胞生成的小分子蛋白，对神经元的生存和凋亡有重要的调节作用[4]。经典的神经营养因子，如脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF），可以通过结合和激活特定的细胞跨膜受体来调节神经元的生存、生长、增殖和迁移[5]。作为非经典的NTF，MANF 具有不同于经典NTFs 的独特结构，因而具有独特的分泌调控机制以及更多功能。MANF由8 个间隔保守的半胱氨酸残基组成，作为内质网伴侣蛋白主要定位于内质网腔内。MANF 主要由神经元细胞及其他具有分泌功能的神经元组织分泌，对多种组织和细胞有营养、缓解内质网应激的作用[6]。

MANF 在各组织与器官中的表达非常广泛。Lindstorm 等通过Northern 杂交及RT-PCR 的方法分析小鼠组织中MANF 的mRNA 的表达情况，结果显示，在小鼠肝脏、睾丸中可检测到MANF mRNA 的高水平表达，而在脑、肺、骨骼肌中，其表达量则相对较低。同时，在肾脏、心脏、脾脏等器官组织中也可检测到MANF 的mRNA 表达，这与人体中MANF mRNA 表达分布情况基本一致[7]。大脑皮层、海马、小脑浦肯野细胞、丘脑和下丘脑中也均可检测到相对较高水平的MANF；MANF 在纹状体中也有表达，但其表达水平较浦肯野细胞低很多。此外，MANF 主要在大脑神经元中表达，且在胚胎和出生后各个阶段，所有脑区（包括纹状体和中脑）均有MANF 表达[8]。

1 MANF 的分子结构

人MANF 蛋白由长度为4.3 kb 的基因编码，该基因位于人第三染色体，有4 个外显子[1]。MANF 前体蛋白肽链由179 个氨基酸组成，由N端的一段含有21 个氨基酸的序列作为信号肽定位于内质网[9]。信号肽裂解后产生158 个氨基酸组成的成熟MANF蛋白（分子量为18 kDa）。Vimal和Hoseki等通过晶体结构及多维核磁共振光谱分析发现成熟的MANF 含有8 个保守的半胱氨酸，形成4 个分子内二硫键[10]。晶体结构分析表明，MANF 有两个结构域，分别为N-末端Saposin 样（鞘脂激活蛋白样）结构域（氨基酸1-95）和C-末端SAP（SAF-A/B，Acinus，and PIAS）结构域（氨基酸104～158）。这两个结构域并不是紧密相连，而是由一个短链连接，各自独立发挥不同的功能[11]。

1.1 N-末端Saposin 样结构域

MANF 的N-末端含有一个典型的闭合环状的Saposin 样结构域。该结构域由5 个α 螺旋和一个310 螺旋组成，呈球状“闭叶”结构，具有疏水核心，三维结构类似于皂苷样蛋白（Saposin-like proteins，SAPLIPs）[12]。研究显示，MANF 的Saposin 样结构域表面具有两个带正电荷的赖氨酸和精氨酸残基，可以与特殊的磷脂酶发生相互作用，认为细胞外的MANF 可能通过该Saposin样结构域结合到细胞膜表面而发挥作用[13]。对MANF N-末端功能的研究发现，小鼠MANF α 螺旋结构的缺失会影响其在细胞内的稳定及分泌，但其机制还需进一步研究[14]。

1.2 C-末端SAP 结构域

MANF 的C-末端结构域与与Ku70 的SAP 结构域同源，Ku70 通过其C-末端的SAP 结构域与促凋亡蛋白Bax（Bcl-2-associated X protein）结合而起到抗凋亡作用。研究发现，MANF 并非直接与Bax 相互作用，而是可以通过Akt/MDM-2/p53途径抑制Bax 依赖的神经元凋亡[13,15]。此外，在MANF 的C-末端中有一些值得注意的特定序列，如CXXC 和RTDL 序列。CXXC 序列与胞内催化二硫键形成的硫醇类氧化还原酶的结构相似，但MANF 不具有氧化还原酶活性。细胞外MANF 可能通过改变细胞表面的蛋白质二硫键的状态发挥其作用，并通过这种翻译后修饰影响细胞内信号传导[16]。RTDL 是内质网滞留信号序列，其与经典的内质网滞留信号序列KDEL 相似。MANF 的RTDL 序列可与定位于顺式高尔基体的KDEL 受体结合,以促进MANF 从高尔基体向内质网的转移。

2 MANF 与神经系统疾病

2.1 神经退行性疾病

帕金森病（Parkinson's disease，PD）、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)等神经退行性疾病是由中枢神经系统（Central nervous system，CNS）神经元逐渐丢失引起的一组慢性进行性神经系统疾病[17]。MANF 对黑质和纹状体的多巴胺能神经元有特异性的保护和损伤后修复作用，因此MANF 可能对帕金森病与阿尔兹海默病的预防和治疗具有极大的应用前景。

2.1.1 帕金森病

帕金森病是一种进行性椎体外系功能障碍的神经退行性疾病，其主要病理特征是纹状体多巴胺（Dopamine，DA）缺乏；中脑黑质致密部大量的多巴胺能神经元丢失，表现为黑质等部位的神经色素脱失；以及在皮质区域、脑干及脊髓区域有α-突触核蛋白聚集，即Lewy 小体[18]。神经毒素如 6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）和α-突触核蛋白低聚物诱导黑质纹状体多巴胺能系统损伤，被广泛用于建立细胞和动物PD 模型[18]。在多个实验模型中，MANF 可以通过多种机制保护6-OHDA 引起的神经毒性作用，其中包括抑制内质网应激、细胞凋亡、自噬和氧化应激等。MANF 过表达可以保护黑质纹状体多巴胺神经元、促进PD 动物模型行为能力的恢复[19]。MANF 可以通过上调内质网应激相关因子如GRP78、Bip以及与内质网定位受体IRE1α 相互作用抑制内质网应激[20]，进而抑制内质网应激介导的细胞凋亡[21,22]等，保护多巴胺能神经元。在LPS 处理的BV-2 细胞中，MANF 可通过激活AKT/GSK3β-Nrf-2信号轴来预防小胶质细胞激活引起神经炎症从而导致的多巴胺能神经退行性病变[23]。在α-突触核蛋白过表达的细胞模型中，MANF 可能作用于核因子红系2 相关因子（Nuclear factor erythroid 2 related factor，Nrf2）介导巨自噬，参与α-突触核蛋白的降解[24]。在6-OHDA 刺激的SH-SY54Y 细胞模型中，外源性MANF 通过激活Nrf-6 参与的PI3K/Akt/GSK3β 途径和ROS-AMPK/mTOR 途径，减轻了细胞损伤和氧化应激[25]。此外，MANF 分别通过激活Akt/mTOR 和Erk/mTOR 通路正向调控了Neuro2a 和SHSY-5Y 细胞的神经突生长[26]。

2.1.2 阿尔茨海默病

与PD 一样,阿尔茨海默病也是神经退行性疾病,其临床特点为进行性认知障碍和记忆损害[27]，其发病机制为神经元纤维缠结以及脑内的β-淀粉样蛋白沉积形成斑块，损害脑组织，造成认知功能障碍[28]。有研究发现，AD 患者大脑颞下回MANF 的含量明显高于正常人，而颞下回是大脑参与认知功能与语言功能的区域，与AD 的发生发展有着密切的关系[29]。各种炎症模型的研究表明，MANF 通过减少ER 应激相关蛋白和负调节NF-κB 途径[30]来预防炎症反应。在β-淀粉样蛋白过表达的细胞模型中，MANF 的表达增加[31]；重组MANF 蛋白处理或MANF 过表达可以通过抑制β-淀粉样蛋白诱导的内质网应激通路的激活，促进细胞的生存。此外，与对照组相比，AD 前期患者MANF 阳性神经元数量显著增加，因此，MANF 也是早期AD 的潜在诊断指标。

2.1.3 其他神经退行性疾病

17 型脊髓小脑共济失调是一种常染色体显性遗传的进行性神经系统退行性疾病，其致病基因编码TATA 结合蛋白（TATA binding protein，TBP），TBP 基因编码区的CAG 重复序列的扩展突变可引起蛋白多聚谷氨酰胺链的延长，进而致病，通常年龄较大的SCA17 小鼠出现更早的神经症状和更严重的浦肯野细胞变性[32]。杨等在小鼠中通过插入基因诱导表达TBP，建立了17 型脊髓小脑共济失调模型，结果MANF 的表达明显减少；而过表达MANF 增加了TBP105Q 细胞神经突的数目、改善了细胞的存活，且可能通过PKC 信号通路改善浦肯野细胞变性[33]。

MANF 在人视网膜和视神经中表达，它在体外和体内保护视网膜神经节细胞免受缺氧和凋亡损伤[34]。还发现黑腹果蝇（DmMANF）中的MANF在苍蝇视觉系统神经元和神经胶质细胞中表达，敲除MANF 导致神经胶质细胞退化[35]。青光眼是一种视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cell，RGC）及其轴突的进行性神经退行性疾病。神经保护的目的是保护青光眼视神经病变受损的神经元。Ko JA 等人用共培养系统研究了上丘分泌的MANF 对RGC 存活的影响，结果提示MANF 可能是RGC 神经保护的重要关键因子[36]，预示MANF 是视网膜疾病的潜在靶标。

中枢神经系统的神经元丧失和神经退行性变是胎儿酒精系谱障碍最具破坏性的特征之一。内质网应激是许多神经退行性疾病的标志和潜在机制，包括乙醇诱导的神经退行性疾病。Wang 等人通过对孕晚期MANF 敲除小鼠的研究发现，MANF 缺乏会加剧乙醇诱导的神经元凋亡和内质网应激，而阻断内质网应激可消除该影响，提示MANF 能通过改善内质网应激改善乙醇诱导的神经元凋亡[37]。

2.2 缺血性脑卒中

缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）是指因脑部血液循环障碍、缺血、缺氧所致的局限性脑组织缺血性坏死或软化。IS 的病理生理机制涉及多个方面，包括缺血后的能量代谢变化；缺血后细胞膜的异常去极化导致大量Ca2+内流，引起神经递质如谷氨酸、多巴胺、γ-氨基丁酸、乙酰胆碱及天冬氨酸等的异常释放；氧自由基生成；内质网应激及细胞凋亡。这些过程导致缺血区域神经元变性，引起行为和认知功能障碍。

MANF 在IS 早期呈时间依赖性上调[38]。在大鼠前脑缺血10 min 模型中，海马体神经元MANF mRNA 水平2 在缺血后4 h 短暂增加，并且在缺血后1 w 恢复到基线。在大鼠短暂的大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion，MCAo）后2-48 h 内，神经元MANF 表达升高，梗死周围区域最为突出。同时在该模型中，IS 导致腺病毒介导的MANF 蛋白从核周细胞质重新分布到细胞表面[39]。总的来说，IS 增加了MANF在动物模型中的表达。然而，对IS 模型MANF 表达的研究主要集中在急性期，未来仍需对动物模型恢复期、后遗症期和死后样本中MANF 的表达情况进行深入研究。

在IS 前后几个小时内，外源性MANF 通过病毒载体或重组蛋白注射到大脑后，具有神经保护作用[39]。Belayev 等人发现，在瞬时MCAo 后使用二十二碳六烯酸通过增加内源性MANF 蛋白表达而发挥神经保护作用[40]。小鼠IS 后3 d，通过小渗透泵持续28 d 脑室内MANF 给药，可促进小鼠神经功能恢复，增加长期神经元存活，减少迟发性脑萎缩和胶质疤痕形成[41]。这些结果均表明MANF 在IS 中对神经元细胞死亡和组织损伤有保护作用。

MANF 通过调节未折叠蛋白反应相关基因、激活Akt/MDM2/P53 通路等方式抑制缺血诱导的神经元凋亡[42,43]。此外，基质金属钛通过降解紧密连接蛋白破坏血脑屏障的完整性，MANF 可通过增加基质金属肽酶9 的活性来减少血脑屏障的损伤[44]。在老年小鼠中，MANF 通过TLR4/MyD88/NF-κB 通路抑制炎症，恢复缺血性卒中/再灌注后的血脑屏障完整性[45]。MANF 部分通过增加血管内皮生长因子的活性，促进血管生成、增加局部脑血流量从而促进脑缺血损伤后的神经行为恢复[46]。此外，内源性MANF 通过促进神经母细胞的分化和迁移及增加脑卒中皮层中神经母细胞的招募，保护了神经干细胞免受氧-葡萄糖剥夺诱导的损伤[47]。

Yan 等人统计了50 例急性缺血性卒中患者、56 例短暂性脑缺血发作患者和48 例对照组血清MANF 的水平，结果表明MANF 水平与神经保护、卒中严重程度、炎症和卒中复发相关[48]。将MANF 修饰的骨髓来源的间充质干细胞注射入大脑，可以抑制细胞凋亡和焦亡相关分子来改善脑梗死后的缺血性损伤，这提示了一种新的缺血性脑卒中的细胞治疗策略[49]。

2.3 其他神经系统疾病

MANF 在机械损伤的模型中具有一定的抗凋亡和抗炎作用，例如减少小鼠挤压损伤模型中的脊髓神经元细胞凋亡并改善创伤性脊髓损伤[15]。此外，MANF 在大鼠及人脑挫裂伤周围组织样本中明显上调，且注射重组人MANF 可以减轻大鼠创伤性脑损伤模型的神经炎症，有良好的神经保护作用[50]。严重的周围神经损伤通常会导致永久性功能残疾。然而，由于缺乏对有效分子靶点的了解，目前缺少用于神经修复的治疗药物。Bautista 等人通过对大鼠的体外再生的背根神经节进行蛋白质组学分析，证明了MANF 是成人神经再生的潜在治疗靶点[51]。

术后谵妄（Postoperative delirium，POD）是老年患者术后常见的神经系统并发症，是一种非特定实质器官脑部综合征，其发病机制之一就是高强度的炎症反应[52]。近期研究发现，人类和小鼠的内源性MANF 均呈年龄依赖性降低，POD 患者术前血清MANF 水平低于非POD 患者，术后血清MANF 的升高低于非POD 患者，这提示相对较低的MANF 水平可能与老年人POD 的发生有关。临床前期研究发现，人重组MANF 抑制了小鼠手术诱导的炎症反应，对小鼠POD 样行为改变具有保护作用[53]。多发性硬化（Multiple sclerosis，MS）是以中枢神经系统局灶性、炎性脱髓鞘为主要病变特点的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是国际上普遍认可的研究MS 的理想动物模型，是研究MS 病理过程、发病机制的重要途径[54]。研究发现，在地塞米松治疗的EAE 小鼠脊髓白质髓鞘区MANF 表达增加，静脉注射rhMANF 可改善EAE 小鼠早期的临床体征和运动行为，这提示MANF 可能是潜在的MS 治疗候选药物[55]。

外周血清MANF 表达水平与抑郁症有关。首发抑郁症患者血清MANF 水平表达降低，而复发抑郁症患者较前者升高，表明抗抑郁治疗会改变血清MANF 水平。血清MANF 表达可能是一个潜在的诊断首发抑郁症的生物标志物。此外，MANF 表达及内质网应激与抑郁症相关。海马MANF 过表达可以改善小鼠抑郁样行为，抑制内质网应激以及炎症反应；相反，海马MANF 沉默会增加小鼠对应激的易感性并诱导产生抑郁样行为，导致内质网应激及炎症反应发生。锂是治疗双相情感障碍的药，其作用机制之一为促进AP-1转录因子介导的MANF 基因表达增加来维持内质网稳态[56]。这预示，MANF 可能是抑郁症及双相情感障碍等精神疾病的潜在治疗靶点。

3 结语

MANF 与多种神经系统疾病关系密切，具有抑制细胞内质网应激、保护和恢复多巴胺神经元功能、提高细胞存活、促进组织再生及抑制神经组织炎症反应的作用。通过深入探究MANF 的作用机制，可以为神经系统疾病的综合治疗提供新的方向。