基于HS-SPME-GC-MS 和多元统计分析三种红茶特征挥发性成分

周 佳，苏 丹，王志霞，任洪涛，黄 媛，于 娟，李亚莉，周红杰,

（1.云南农业大学茶学院，云南昆明 650000；2.信阳农林学院茶学院，河南信阳 464000；3.云南农业大学香料研究所，云南昆明 650000）

红茶是世界上产量最高、消费区域最广、贸易量最大的茶类[1-4]。我国红茶按地域可分为祁红、滇红、川红等[5]。香气是决定茶叶品质的重要指标，也是形成茶叶风味与品质特征的重要因子。香气特征不仅影响茶叶的等级，也是大众消费的重要导向之一[6-8]。红茶中挥发性成分的种类和含量直接影响红茶香气及香型，因此对红茶挥发性成分与香气品质关系的研究一直是茶叶科学的热门领域，具有重要的实用价值和研究价值[9-11]。目前顶空固相微萃取（HSSPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）方法已广泛应用于各种食品和药品挥发性成分的研究[12-13]。HS-SPME 是一种绿色环保型样品分析前处理技术，具有敏感、快速、操作简单、样品用量少、不用溶剂等优点[6,14-18]。通过配置全自动顶空进样装置的GC-MS，可实现复杂样品检测的高通量、自动化，大大降低人工操作误差，同时提高工作效率[6,14]。

在我国众多的红茶种类中，滇红和祁红是很受欢迎的传统特色红茶[19-20]，近年兴起的GABA 红茶也受到了消费者的青睐。目前，对滇红与祁红挥发性成分已有研究报道，任洪涛等[21]对不同级别云南工夫红茶香气成分进行了比较研究，刘盼盼等[22]对17 个国内主产茶区工夫红茶进行了品质分析与综合评价，罗学平等[23]采用固相微萃取（SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用法对川红、滇红和祁红香气成分进行分析。但是对GABA 红茶挥发性成分的研究较少，缺少有力的风味品质研究的基础理论支撑，因此尚需深入研究，同时也未见对这三种红茶挥发性成分的综合比较研究。

因此，本研究以这3 种红茶为研究对象，采用HS-SPME-GC-MS 结合多元统计方法解析三种红茶的关键香气物质及差异，以期为祁门红茶、GABA 红茶、滇红香气品质差异奠定理论基础，为科学客观地评价GABA 红茶香气品质和培育新型优质红茶提供参考，并为构建不同种类红茶风味品质鉴别图谱提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

祁门红茶 安徽祁门祥源茶叶公司制备，品种为祁门槠叶种；GABA 红茶 云南省大理市云龙县大栗树茶厂利用厌氧处理技术制备，品种为云抗十号；滇红 由云南滇红集团股份有限公司制备，品种为云抗十号。三种茶样茶鲜叶均于2022 年4 月按一芽一二叶标准进行采摘，基本制备流程为萎凋、揉捻、发酵、干燥。癸酸乙酯 西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

CTC 自动进样器、HP7890A-5975C 型GC-MS联用仪、HP-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）

美国Agilent 公司；65 μm 聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取头 美国Supelco 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HS-SPME 条件 称取磨碎茶样1.00 g 放入20 mL 顶空瓶中，加入1.00 μg 癸酸乙酯作为内标，加入5 mL 沸水，密封瓶口。将CTC 自动进样器于60 ℃条件下稳定10 min，保证进样稳定性；并采用65 μm PDMS/DVB 萃取头，在250 r/min、60 ℃条件下孵化50 min，所有样品重复3 次，进行数据采集[24]。

1.2.2 GC 条件 以氦气（He，纯度＞99.999%）为载气。HP-5MS 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），不分流进样，进样口温度230 ℃，脱吸附时间5 min；升温程序：初始温度50 ℃保持5 min，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。

1.2.3 MS 条件 电子电离源：离子源温度230 ℃；接口温度280 ℃；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z 35～500。

1.3 数据处理

根据样品总离子流图，结合谱库检索（Wiley 和NIST 库）和前人相关研究[24-25]，对三种红茶挥发性成分进行鉴定，以癸酸乙酯为内标，采用内标法定量计算各组分含量，计算公式如下：采用Excel 2019 进行数据整理；TBtools 1.098对香气组分进行层次聚类和热图绘制；偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）由代谢组学数据分析网站MetaboAnalyst进行分析。

2 结果与分析

2.1 三种红茶挥发性成分的定性及定量分析

采用GC-MS 对三种红茶样品的挥发性成分进行检测，通过谱库检索、保留指数、特征离子对比，共定性鉴定出78 种已知挥发性成分（表1：Q-祁门红茶；G-GABA 红茶；D-滇红），按照其化学结构性质可分为8 类，包括萜烯类、碳氢化合物、醇类、醛类、酮类、酯类、酚类、杂环化合物。其中，碳氢化合物的种类最多（24 种），以烷烃和萘为主，萜烯类（14 种）、醇类（9 种）、酯类（9 种）、酮类（8 种）、醛类（7 种）、杂环化合物（5 种）的种类次之，最少的是酚类（2 种）。祁门红茶的挥发性成分共8 类58 种，GABA 红茶的挥发性成分为8 类60 种，滇红的挥发性成分为7 类58 种，滇红中未检测出酚类物质。由此也可看出，除GABA 红茶的挥发性成分数量略多外，三种红茶在总挥发性物质种类数量方面差异较小。

三种红茶的挥发性物质中，碳氢化合物和萜烯类种类数量较多，但含量偏低；醇类物质种类偏少，但其含量最高（图1）。三种红茶在总挥发性物质种类数量方面差异较小，但其含量差异较大。祁门红茶挥发性物质的总含量为14.45 μg/g，GABA 红茶为18.7 μg/g，滇红为21.3 μg/g，说明茶树品种对挥发性物质的含量高低有较大影响。相对而言，由云南大叶种所制红茶，其挥发性物质总含量更高；由中小叶种所制的祁门红茶，其挥发性物质总量则偏低。但就GABA 红茶与滇红，经过厌氧处理的GABA 红茶挥发性物质总量低于滇红，也说明厌氧处理的过程中会使部分挥发性物质消失，最终成茶中挥发性物质总量减少。

图1 三种红茶挥发性成分总含量对比Fig.1 Comparison of total volatile components in three kinds of black tea

三种红茶中共有挥发性成分43 种（图2），主要包括芳樟醇、香叶醇、壬醛、水杨酸甲酯、氧化芳樟醇等，这也是三类红茶花果香、甜香突出的物质基础。已有研究表明，芳樟醇及其氧化物、香叶醇、水杨酸甲酯等是红茶特征性香气物质，与本研究结果相符[26-27]。

图2 三种红茶共有和特有挥发性香气成分种类分布图Fig.2 Distribution map of common and unique volatile aroma components in three kinds of black tea

祁门红茶特有挥发性成分9 种，主要有苯乙醇、法呢醇、苯甲醛、癸醛等。苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香，法呢醇呈淡的白柠檬似香味，癸醛具有似甜橙油与柠檬油以及玫瑰的香气[28]，这些香气物质有利于祁门红茶在花香的基础上，玫瑰香型和柠檬香型的提升。GABA 红茶特有挥发性成分6 种，主要有茉莉酮、1-甲基双环[6.4.0]十二烷-11-酮等。茉莉酮呈优雅的茉莉花香[29]，有利于GABA 红茶茉莉香型的呈现。滇红特有挥发性成分8 种，主要有萜品油烯、顺式-β-罗勒烯、α-萜品烯等，其中α-萜品烯具有柑橘和柠檬似香气[30]，有助于滇红果香的体现。

2.2 多元统计分析三种红茶挥发性成分

2.2.1 基于三种红茶挥发性成分的聚类及热图分析

为进一步探究挥发性成分与三种红茶的关系，对其挥发性成分进行层次聚类分析，结果如图3A 显示。通过聚类分析可将其分为两类，分别为组1 和组2，第一组包括GABA 红茶和滇红，第二组包括祁门红茶。因此，根据挥发性物质的不同可以区分GABA红茶、滇红、祁门红茶，也进一步印证了茶树品种的不同对成茶的挥发性物质会产生重要影响。

图3 三种红茶挥发性成分的层次聚类（A）及热图（B）Fig.3 Hierarchical clustering (A) and heat map (B) of volatile components in three black tea

除聚类分析外，还进行了热图分析（图3B），以表征三种红茶中挥发性成分的差异。热图结果显示，祁门红茶中α-古巴烯、δ-杜松油烯、α-白菖考烯、香叶醇、橙花醇、β-环柠檬醛、顺式-香叶基丙酮、反式-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、醋酸橙花酯等挥发性物质的含量普遍较高，明显高于其他两类，而这些物质大多具有较好的香型，对成品茶香气的贡献较大。滇红中D-柠檬烯、反式-β-罗勒烯、二十烷、十六烷、正十七烷、萘、壬醛、3-十一酮、氧化芳樟醇、芳樟醇氧化物（顺式吡喃型）、2-（2-呋喃基）-5-呋喃甲醛等挥发性物质的含量要更高，除部分萜烯类与杂环化合物外，烷烃类挥发性物质对香气贡献很小。GABA 红茶中2-甲基十八烷、壬基环戊烷、反式-3-丁酸己烯酯、顺-3-己酸己烯酯等挥发性物质的含量普遍较高，以烷烃和酯类为主，除顺-3-己酸己烯酯外，都对香气贡献很小。由此也可看出，经厌氧处理后的GABA 红茶，有利于顺-3-己酸己烯酯含量的增加。

总而言之，祁门红茶虽挥发性物质总含量较低，但其挥发性含量普遍较高的物质中具有较多芳香气息的物质，种类丰富且含量较高。GABA 红茶虽在含量总量明显高于祁门红茶，但其含量普遍较高的挥发性物质对成茶香气贡献不大。而滇红总挥发性物质含量在三者之中最高，且部分对香气贡献度较高的萜烯类与杂环化合物也明显高于其他两类。

2.2.2 基于PLS-DA 分析三种红茶关键挥发性成分

PLS-DA 是一种新的多因变量到多因变量回归建模的多元统计方法，可以准确地确定影响群体的关键变量[28,31]。利用PLS-DA 进一步筛选影响三种红茶香气特征的关键挥发性物质，其中，变量重要性因子（VIP）可以量化每个变量对分类的贡献。当VIP 值＞1 时，对应变量可定义为判别模型的关键变量[32]。

PLS-DA 的得分图表明茶叶样品有明显的分离，PC1 和PC2 分别解释了总方差的74.8%和25.2%（图4A）。这些结果表明，三种红茶中挥发性成分有较大差异。根据VIP 值（VIP＞1）和P值（P＜0.05）筛选出关键挥发性成分，结果显示共筛选出12 种差异挥发性物质（图4B），其中酯类5 种、醇类2 种、酚类2 种、醛类1 种、萜烯类1 种、碳氢化合物1 种，分别为醋酸橙花酯、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈酸甲酯、顺-3-己烯基异戊酸酯、水杨酸甲酯、异龙脑、芳樟醇、3-甲基-4-氨基苯酚、4-氨基-2-甲基苯酚、柠檬醛、蒈烯、5-甲基十四烷。

图4 三种红茶挥发性成分偏最小二乘-判别分析Fig.4 Partial least squares discriminant analysis of volatile components in three black tea

根据VIP 值（VIP＞1）筛选出的12 种差异挥发性物质中，通过查阅文献发现6 种具有明显香气特征的物质（表2），通过分层聚类热图可将这六种香气成分完全划分为三类，分别为I 类、II 类、III 类（图4C）。

表2 三种红茶中主要差异性香气成分及其特征Table 2 Main differential aroma components and their characteristics in three kinds of black tea

I 类共2 种挥发性成分，包括醋酸橙花酯、柠檬醛。醋酸橙花酯一般呈橙花和玫瑰香气及蜂蜜和覆盆子甜香味，柠檬醛则呈浓郁柠檬香味，这些香气物质有助于祁门红茶花果香的体现，尤其体现为玫瑰香型和柠檬香型的提升。结果还表明（图5），祁门红茶中这两种物质含量明显高于GABA 红茶与滇红，并且滇红中不含有这两类香气物质，但经过厌氧处理方式加工而成的GABA 红茶中这两类香气物质显现，说明厌氧处理在一定程度上能促进醋酸橙花酯和柠檬醛的产生，对形成GABA 红茶花果香具有一定作用。

图5 六种香气物质在三种红茶中的含量对比情况Fig.5 Comparison of six aroma substances in three kinds of black tea

II 类共2 种挥发性成分，包括异龙脑、邻苯二甲酸二异丁酯。其中，异龙脑有近似樟脑的气味，这两类物质在祁门红茶中并未检测出（图5），滇红中含量最高，在GABA 红茶中则有所降低，由此可看出厌氧处理一定程度上对抑制异龙脑的增加有影响。

III 类共2 种挥发性成分，包括芳樟醇、水杨酸甲酯。芳樟醇具有甜嫩新鲜的花香，似铃兰香气，水杨酸甲酯具有冬青叶香味。这两类物质在GABA 红茶与滇红中的含量明显高于祁门红茶且实际含量很高（图5），有助于GABA 红茶与滇红甜香、花香的富集。还可看出芳樟醇经过厌氧处理后含量有所降低。

3 结论

本文对GABA 红茶、滇红、祁门红茶的挥发性成分进行研究，共定性鉴定出78 种已知挥发性成分，三种红茶香气成分具有一定的相似性，根据挥发性物质的香气特征，均有利于红茶甜香与花果香的体现。三种红茶总挥发性物质种类数量接近，但三种红茶挥发性风味物质又有明显差异，主要体现在挥发性物质含量的高低和香型的不同。

祁门红茶香气物质种类丰富且含量较高，特有苯乙醇、法呢醇、苯甲醛、癸醛等，再者祁门红茶中醋酸橙花酯、柠檬醛明显高于其他两类，这些香气物质有助于祁门红茶花果香的体现，尤其体现为玫瑰香型和柠檬香型的提升；GABA 红茶和滇红总挥发性物质含量相比祁门红茶更高，GABA 红茶除顺-3-己酸己烯酯外，含量普遍较高的挥发性物质对成茶香气贡献不大，特有茉莉酮、1-甲基双环[6.4.0]十二烷-11-酮等，有利于GABA 红茶花香中茉莉香型更显；滇红总挥发性物质含量在三者之中最高，且部分对香气贡献度较高的萜烯类与杂环化合物明显高于其他两类，特有萜品油烯、顺式-β-罗勒烯、α-萜品烯等，再者芳樟醇含量也明显高于其他两类，有助于滇红甜香、花果香的富集。通过PLS-DA 分析明确了醋酸橙花酯、水杨酸甲酯、异龙脑、芳樟醇、柠檬醛等关键挥发性成分，可以明显区分三种红茶。

此外发现茶树品种对红茶挥发性成分有重要影响，由云南大叶种所制红茶其挥发性物质总含量更高，这与曹晓念等[35]研究结果一致。同时厌氧工艺的处理会促进醋酸橙花酯、柠檬醛、顺-3-己酸己烯酯等香气物质的显现与增加，但一定程度上会抑制异龙脑、芳樟醇等物质的升高。

本文通过对三种红茶挥发性物质进行研究，确定其关键挥发性成分，为三种红茶品质差异奠定理论基础，并为构建不同种类红茶风味品质鉴别图谱提供数据支撑，也为科学客观地评价GABA 红茶香气品质提供理论支持。同时厌氧等工艺的处理为培育新型优质红茶提供参考，为进一步丰富红茶品类、开拓红茶市场以及为红茶产业的持续健康发展提供技术与理论支撑。由于三种红茶的香气品质可能受到其他因素的影响，如土壤条件、栽培海拔高度等。还需进一步控制变量并增加试验样本，并进一步结合GC-O、OAV 和气相色谱离子迁移谱等技术开展三种红茶香气研究，以期为三者品质评定提供更多客观依据。