Na+/H+交换体家族第三个亚型在感染性腹泻中的作用及活性调控机制

王思盈,邹 宏,宋振辉

(西南大学动物医学院,重庆 402460)

哺乳动物转运蛋白的溶质载体9A家族(solute carrier 9A,SLC9A),即Na+/H+交换蛋白(Na+/H+exchangers,NHEs),是真核和原核单价的一个亚组阳离子质子反转运蛋白超家族。该蛋白家族主要通过将胞外Na+转运到胞内、将胞内H+转运到胞外来发挥其pH稳态调节功能[1-2]。目前已发现有9种钠氢交换蛋白,各亚型间具有结构相似性和组织分布特异性。其中,Na+/H+交换体家族第三个亚型(Na+/H+exchanger isoform 3,NHE3)高度表达于肾和胃肠上皮,通过Na+浓度梯度驱动来负责细胞内水和Na+的吸收。它的运输功能对于维持身体的盐和水稳态以及酸碱平衡至关重要,大多数发现表明,NHE3转运功能在高血压发作前被激活,此后受到抑制;在糖尿病、肾病和心力衰竭中也上调[3]。当胃肠上皮细胞顶膜的NHE3活性受到抑制时,Na+转运就会出现障碍,从而肠道内的水电解质潴留、营养物质吸收停滞,最终导致腹泻的发生[4]。近年来,有关NHE3在腹泻中的作用研究日益增多,涉及NHE3活动的机理研究也不断被揭示,全面阐述NHE3生理功能及在感染性腹泻中的调控机制,对有效预防和靶向治疗感染性腹泻具有重要借鉴。

1 NHEs基因家族简介

1989年Sardet等克隆了第一个NHE基因。迄今为止,人们已在哺乳动物中发现了9种具有不同的组织分布和功能特性的亚型,共同构成膜交换蛋白的一个基因家族[5]。钠氢交换蛋白家族包含有11个成员,分别命名为NHE1～NHE11,共同构成一个膜交换蛋白家族[6]。9种NHE亚型均由600～900个氨基酸组成,约有40%的氨基酸相似性,相互之间的差异主要在于从跨膜(transmembrane,TM)段到胞质部分的碱基序列不同。NHE各亚型具有不同的组织分布及亚细胞定位,细胞学功能也不相同(表1)[7]。这些亚型根据其分布大致可以分为两组:主要在质膜中存在和起作用的NHEs(NHE1～5)和主要或仅在内膜细胞器中的NHE6、7、9、10[8]。其中,NHE1亚型表达最广泛,其在所有组织的细胞中普遍表达,也被称为管家基因亚型,主要定位于质膜,是pH稳态和细胞体积调节的主要调节因子[9]。NHE2之前被认为在Na+的吸收中起作用,但是小鼠缺失NHE2对肠道Na+的吸收没有产生影响,后发现其缺失会引起胃壁细胞活动异常[10-11]。NHE3在小肠、结肠和肾近端小管的顶端膜中高度表达,是机体上皮细胞顶膜电中性Na+吸收的主要转运载体[12]。NHE4在胃上皮细胞中丰富存在,表达主要局限于胃中,功能与NHE2类似[13]。NHE5主要在大脑中表达,但也在脾、睾丸和肌肉等组织中存在,被认为是树突棘生长的负调控因子[14]。NHE6、7和9具有较高的同源性,主要存在于脑、心等线粒体丰富的组织,能帮助建立细胞器的特异性和维持pH稳态。NHE8主要高表达于胃中,在Na+吸收早期和保护胃肠道黏膜方面发挥作用[15-16]。NHE9定位于晚期回收小泡,其过表达会促使肿瘤生长的癌信号持续存在[17]。作为破骨细胞特异性成员NHE10,可调节破骨细胞分化和存活[18]。NHE11为最新发现的亚型,其生理功能报道甚少,还有待进一步研究。

表1 钠氢交换蛋白基因家族和组织分布

2 NHE3分子结构及生理功能

NHEs各亚型之间的结构也很相似,包括12个跨膜螺旋的N端域和1个相同C端胞质域,其中N端膜结构域(50%～60%)的保守性明显大于C末端序列的相似性(20%～23%),C端区域决定了不同Na+/H+交换体之间激酶调节的差异[12]。NHE3分子二级拓扑结构和其他亚型相似,由831个氨基酸残基组成,其中1～454位氨基酸组成N-terminal疏水膜,而455～831位氨基酸组成C-terminal亲水膜(图1)。其N端有13个跨膜的α螺旋,主要在离子交换中共同发挥作用,也是NHE最固定的序列;C端则通过连接细胞骨架和调节因子实现对NHE3活性的调节[19]。其中,猪的NHE3基因全长约78.5 kb,mRNA约6.1 kb,cDNA能编码836个氨基酸残基,蛋白大小约为93 ku[20]。作为胃肠道中钠氢交换剂,NHE3不以单体的形式存在而是以动态大分子复合物存在,所以存在着多个蛋白结合位点。例如,NHE3 COOH末端在氨基酸585和689之间结合钠氢交换调节因子(Na+/H+exchanger regulatory factor,NHERF),NHERFs同时结合NHE3,并通过与Ezrin结合将其与肌动蛋白细胞骨架连接,同时通过两个PDZ结构域(PDZ domain containing,PDZ)和COOH末端ERM(ezrin/radixin/moesin)结合结构域组装多蛋白信号传导复合物[21]。

图1 NHE3分子结构图

NHE3在结肠、肾、小肠、胆囊与胃中表达较高,在胸腺、卵巢、前列腺以及腹外侧髓质的一些呼吸系统也有发现,且不同物种的表达位置存在差异性,其特殊的组织分布也决定着特殊的生理作用[22]。经过多年研究发现,NHE3在血压调节、肾脏容量和腹泻等方面起着重要的生理调节作用。McDonough等[23]通过NHE3敲除小鼠出现低血容量、低压、轻度代谢性酸中毒和腹泻现象,证明了NHE3是肾和肠道的主要Na+转运体。其中,肾近端小管中的NHE3负责大量Na+和水的重吸收,并且仅在近端小管中存在或丧失NHE3功能就足以改变基础血压稳态[24]。在分化的肠上皮细胞的顶端膜中表达的NHE3,是肠道中主要的营养依赖性Na+和水的吸收机制。NHE3还通过H+梯度调节其他营养素的吸收,例如二肽和氨基酸等[25]。由于NHE3对Na+的吸收作用,所以其对体液和血压稳态以及酸碱调节有显著贡献[26-27]。

3 NHE3在腹泻中的作用

目前研究认为,肠上皮细胞吸收Na+可分为3型:电中性、生电性和与有机物质偶联的NaCl吸收,有研究表明肠腔侧Na+/H+交换子介导的电中性是NaCl被吸收的主要途径,而肠道中的NHE3是肠道电中性钠吸收的重要运载体[28]。细胞顺化学梯度进行Na+转运时,也为H+向胞外转运提供能量,促进H+分泌到胞外造成细胞内pH升高,这一过程将促使HCO3-向细胞外转运,进而通过其偶联的Cl-/HCO3-交换体使Cl-被转运进入细胞内,精密调控肠道分泌和吸收平衡。1985年,Ganapathy和Leibach提出肠道肽的吸收依赖于刷状边界膜上的质子梯度,并且顶膜中的Na+/H+交换机制与基底外侧膜中的Na+/K+-ATP酶结合将产生并维持该质子梯度。在后来的细胞内pH值可在功能上耦合Na+和二肽的吸收试验中也确实证实了Ganapathy和Leibach的假设。2001年,Ledoussal等[29]发现了NHE3基因敲除小鼠的腹泻情况在NHE3/NHE2双敲除小鼠中不会进一步恶化,再次证实了NHE3是Na+和体液吸收的主要参与者。2017年Karasov等[30]探究了NHE3的活性变化是肠道Na+吸收的主要原因,同时还伴随旁细胞的水分吸收。由此可见 NHE3 介导的 Na+交换在腹泻中具有十分重要的作用[31],当细菌、病毒和毒素等病原进入肠道后,会引起肠上皮细胞上相应的NHE3活性发生受到抑制、Na+转运出现障碍时,肠道内就会出现营养物质吸收停滞、水电解质潴留,最终导致腹泻的发生。

4 NHE3在感染性腹泻中的活性调控研究

4.1 病毒感染对肠道NHE3的活性影响

许多病毒均可感染肠上皮细胞,且一般以小肠作为入侵靶点,引起各种炎症因子的表达水平提高,从而发生炎症损伤反应,同时也会引起肠上皮细胞的离子通道活性和表达降低,如当NHE3活性受到抑制、Na+转运出现障碍时,则会引发腹泻。

目前,Niu等[32]已证实猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染猪小肠上皮细胞后Na+/H+交换蛋白3的表达显着降低。2018年,Yang等[33]初步验证了TGEV与猪小肠上皮细胞(intestinal porcine enterocyte J2,IPEC-J2)的特异性结合受体表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)结合后,会进一步激活EGFR和磷酸化细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK),调控Na+/H+交换蛋白NHE3的表达和活性。Yang等[34]则验证了在TGEV感染情况下抑制钠-葡萄糖共转运蛋白1(sodium-glucose cotransporter 1,SGLT1)的表达会使得丝裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶-2(mitogen-activated protein kinase-activating protein kinase-2,MAPKAPK-2)和 Ezrin 磷酸化水平上调,且细胞质膜上 NHE3 的表达量也显著上调。余秋寒等[35]则在此基础上探究了TGEV感染能上调磷酸化Ezrin表达水平,且随着感染时间增加网格蛋白转录水平与表达水平呈下调趋势。Niu等[36]则进一步通过荧光共定位与Co-IP技术,证实了TGEV N蛋白与NHE3间存在互作关系,并且利用分子对接与计算机辅助筛选技术筛选出针对N蛋白与NHE3结合域的小分子抑制剂伊立替康,在通过动物试验后发现其具有一定的治疗作。同一时期,晏涛等[37]则验证了EGFR/ERK 信号通路参与了与TGEV同属的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染对NHE3的调控,发现PEDV感染情况下EGFR能负反馈调节NHE3 的活性。

近年来,关于轮状病毒(rotavirus,RV)引起腹泻对NHE3蛋白水平及其生物活性的影响也取得了部分研究进展。王昕等[38]在2018年将构建好的表达NHE3的人小肠上皮细胞(the human epithelial cell line,Caco-2)模型分成CT组和RV组,通过BCECF-AM法和细胞表面NHE3生物素化法测定Na+/H+交换活性和细胞表面NHE3蛋白水平,发现RV感染Caco-2细胞60 min后,细胞NHE3 转运活性下降近60%,在感染后期能显著降低细胞表面 NHE3/总NHE3 的比值。牛美兰等[39]则在此基础上,进一步探究了网格蛋白内吞途径介导的NHE3调控作用,发现网格蛋白拮抗剂CPZ可在一定程度上有效拮抗RV感染对细胞表面NHE3水平和生物活性的抑制作用,但此抑制作用不能被拮抗剂CPZ完全抵消。王鹏等[40]则通过脂筏破坏剂甲基β-环糊精(methyl-beta-cyclodextrin,MβCD)破坏细胞膜脂筏检测NHE3细胞表面蛋白含量和Na+/H+交换活性,此时脂筏介导的细胞NHE3内吞和胞吐作用将被抑制,结果发现MβCD可有效拮抗 RV感染对细胞表面NHE3蛋白的量及活性的抑制,甚至使感染后的细胞表面NHE3恢复至正常水平,这一现象提示RV可通过脂筏依赖性转运途径抑制细胞表面NHE3蛋白的量及活性。在其另一项研究中发现,在脂筏依赖性内吞途径中,细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)发挥着不可或缺的作用[41]。

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)引起的腹泻发生率为2%～50%,Donowitz等[42]通过将严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)与受试者接触,发现病毒培养2 d后,血管紧张素转换酶Ⅱ、NHE3和溶质载体家族26成员3[SLC26A3,又称DRA(downregulated in adenoma)]的mRNA水平降低,NHE3蛋白也减少,最后推断COVID-19引起的腹泻似乎是钙依赖性炎症性腹泻,并可能抑制中性NaCl的吸收(减少NHE3蛋白和mRNA,减少DRA mRNA)。Pearce等[43]研究了SARS-CoV-2感染时多种转运蛋白的变化,发现与耳鼻喉科、肠道内杯状细胞和潘氏细胞相比,肠道干细胞的NHE3会显著降低。M C Cure和E Cure[44-45]发现COVID-19中NHE活化时间延长可能导致细胞外H+离子积累和随后的氧化还原反应而导致细胞内pH降低,长时间的 NHE 激活可能是 COVID-19 中细胞因子释放综合征的原因;进一步发现SARS-CoV-2可以通过破坏肠道微生物群,通过NHE3抑制触发心肾综合征。

4.2 细菌感染对肠道NHE3的活性调控

多种细菌均可感染胃肠道抑制NHE3的活性并引起腹泻,包括霍乱弧菌、肠病性大肠杆菌(enteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)和艰难梭菌[46]。霍乱弧菌感染会增加Cl-分泌,并降低Na+的吸收,因为该细菌会分泌一种典型的AB毒素即霍乱毒素(cholera-toxin encoding phage,CTX),CTX可以诱导宿主质膜释放腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC),增加3′,5′-环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的浓度,激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)[47-48]。PKA通过刺激刷状边界的囊性纤维化跨膜传导调节因子以介导Na+/H+反转运蛋白NHE3的内吞作用磷酸化,并降低质膜中的NHE3蛋白丰度,同时还阻止NHE3递送到表面膜[48]。

EPEC是人和动物腹泻的重要病原之一,关于EPEC感染引发腹泻目前已发现了包括钠/氢交换、氯化物/碳酸氢盐交换、钠葡萄糖共转运和丁酸盐摄取等多种离子转运过程。EPEC产生两种不同的肠毒素,通过两种不同的受体和第二信使系统诱导液体和电解质分泌:不耐热肠毒素与顶膜受体结合后内化,激活基底外侧腺苷酸环化酶(AC),促使细胞质中的环磷酸腺苷(cAMP)含量持续增高;耐热肠毒素与神经节苷酯GM1受体结合后刺激肠上皮细胞中鸟苷酸环化酶(GC)的分泌,可使细胞浆中环磷酸鸟苷酸(cGMP)的分泌上升并激活cGMP效应蛋白激酶G[3]。研究报道EPEC感染会导致肠上皮细胞中NHE3活性的下降,但具体抑制NHE3的信号级联反应尚未阐明。Hecht等[49]2004年研究发现钠氢交换剂活性在EPEC感染时受到差异调节,在伴随NHE3活性降低的同时存在NHE2代偿性的大幅摄取Na+。Hodges等[50]则确定NHE3活性的变化是效应蛋白EspF特有的,EspF可能通过与分拣微管连接蛋白9相互作用改变囊泡贩运进一步调节NHE3活性。Jekin等[51]则通过IEC系和人源化小鼠验证了Nedd4-2依赖性的泛素化增强了霍乱毒素和肠致病性大肠杆菌对人类NHE3的抑制作用。

艰难梭菌是导致艰难梭菌相关性腹泻,假膜性结肠炎的主要病原体,其可以抑制上皮细胞的 NHEs活性。目前已经发现艰难梭菌B可以通过两种方式抑制上皮细胞NHE3的作用:其一是Hayashi等[52]和Lee等[53]已经证明的艰难梭菌毒素B诱导了Ezrin的去磷酸化,其通过使Rho GTP酶(rho GTP-binding proteins)的失活来破坏 NHE3 与微绒毛肌动蛋白间的相互作用,以促进NHE3发生内化和活性受损;其二是可以破坏rho鸟嘌呤核苷酸交换因子7与SH3同源结构域2(Src homology domains 3,SH3)和多个锚蛋白形成的重复结构域,该结构域具有维持顶端膜 NHE3表达的功能[54]。

4.3 其他病原生物侵染对腹泻时NHE3的影响

在Enns等[55]2019年的研究中,发现猪密螺旋体(B.hyodysenteriae)和汉普森细螺旋体(B.hampsonii)引起的腹泻与NHE3活性有关,且发现NHE3 mRNA和蛋白质水平的降低与之前认为的是由于宿主细胞因子引起的有所不同。近年来的研究发现细胞因子IL-1α没有减少Caco-2细胞中NHE3 mRNA的表达,而全细胞汉普森细螺旋体裂解物能显著下调NHE3的mRNA表达并显著增加Caco-2细胞中p38磷酸化,这些数据表明存在一种潜在的信号传导机制使得两种短螺旋体能直接抑制NHE3的转录和翻译,从而导致腹泻的发生[56-57]。隐孢子虫感染这种在世界范围内发生的人畜共患腹泻疾病,在感染仔猪时会引起严重的肠道菌群失调和腹泻[58]。在Kumar等[59]的研究中,发现溶质载体家族26成员3(solute carrier family 26 member 3,SLC26A3)在肠道上皮细胞中的表达和功能因细小隐孢子虫感染而减少。SLC26A3与NHE亚型一起参与肠道的电中性吸收,但细小隐孢子虫感染所引起的腹泻中,NHE3发挥的具体作用还待进一步研究[60]。

5 NHE3活性调控

生理情况下,NHE3经转录、翻译后由内涵体在细胞质和细胞膜间转运,但只有存在于细胞膜上的NHE3才能发挥离子交换作用[61]。细胞膜上的NHE3又可分为可移动型和不移动型,其中不可移动型约占70%[62]。可移动型被内化后胞吞,经胞内循环后被调控至细胞表面发挥作用,不可移动型与细胞骨架蛋白结合形成复合物转运Na+。通常NHE3在多蛋白复合物中的上皮刷状缘和细胞内隔室之间循环,并且复合物的大小随着结合蛋白的快速调节而变化,这种在隔室之间的交换运动是改变其在质膜上数量的一种手段,也是一种调节表面NHE3活性的方式。NHE3在上皮细胞顶端膜和细胞内的活性受到多种机制的调控,且较为复杂多样,可区分为NHE3的长期(慢性)和短期(急性)调控,主要包括基因转录水平的长期调节,各种蛋白质磷酸化和激酶之间的动态相互作用以及质膜和不同胞内区室之间运输的急性调节。

5.1 转录和翻译水平的调节

糖皮质激素、醛固酮、代谢性酸中毒和丁酸盐主要通过影响NHE3的转录来实现对NHE3的调控。丁酸盐是一种短链脂肪酸,通过结肠中的微生物发酵膳食纤维所产生,它可以增强结肠对NaCl的吸收,并且丁酸钠可以诱导Sp1的磷酸化和Sp3的乙酰化调节,从而调控NHE3基因的启动子[63]。Musch等[64]对大鼠进行连续2 d的纤维补充后,检测到大鼠体内NHE3 mRNA和蛋白质水平的升高继发于结肠中Na+摄取量的增加。在Amin等[65]的瞬时转染研究中,丁酸钠在孵育细胞24 h后会给予NHE3启动子10倍刺激活性。Muthusamy等[66]的研究则发现敲低肝细胞核因子4α可以显着降低了NHE3 mRNA和NHE3蛋白水平,其可以直接调节NHE3启动子的活性。很久前糖皮质激素就被验证能在转录水平上增加肠道和肾中水和电解质的吸收,对NHE3活性和mRNA丰度也有增强作用。但近年来有研究表明糖皮质激素可以通过胞吐作用快速诱导细胞表面NHE3蛋白含量的增加[67],He等[68]和Wang等[69]还发现糖皮质激素可以通过NHERF2支架促进血清和糖皮质激素调节激酶1(serum and glucocorticoid-induced kinase 1,SGK1)对NHE3的磷酸化从而实现NHE3易位到细胞表面实现急性调控,这一发现在后来的Grahammer等[70]使用缺乏SGK1表达的小鼠中,糖皮质激素介导的NHE3活性和NHE3易位到小鼠肠的顶膜显著减弱得到了验证。

在翻译水平上,Anbazhagan等[71]将miR-326和miR-330-5p模拟物转染到人结直肠癌细胞中,显著降低了NHE3蛋白表达,而NHE3信使核糖核酸水平没有变化,探究了MicroRNA通过翻译抑制对NHE3进行转录后调节的新机制。在大鼠肾和负鼠肾细胞中,Hu等[72]已证明多巴胺可以作用于NHE3 mRNA的5′-未端翻译区域中的顺式序列来降低NHE3翻译,长期应用多巴胺会增加NHE3泛素化降解。然而,急性多巴胺效应会介导NHE3/磷酸化NHE3比值降低,导致NHE3被囊泡内吞[73]。所以,尽管多种激素常被认为在转录和翻译水平上调节NHE3的活性,但随着各项研究的逐步深入,多种激素可能在快速调控NHE3含量上也发挥着作用,并且存在着调节其他NHE亚型活性的作用。

5.2 NHE3的内吞作用

转运蛋白NHE3与上皮细胞中的高尔基体、内体和溶酶体等细胞器一样,参与细胞内区室之间的循环转运[74]。细胞内NHE3是活化的,且可通过内腔Na+与胞质H+的交换促进内膜室的酸化,胞吐和胞吞之间的平衡决定了NHE3的膜表面表达水平,但是并非所有的质膜交换都同样容易被内吞。事实上,70%的 NHE3亚群部分地通过微绒毛肌动蛋白细胞骨架介导的物理保留机制定位于膜表面导致运动受限,无法参与内吞作用,只有那些能在膜中扩散进入网格蛋白包裹的凹坑的蛋白才能被内化[75]。研究表明,循环的cAMP、cGMP、升高的Ca2+以及引起这些第二信使增加的神经体液物质和细菌毒素会抑制质膜表面NHE3的活性,增加NHE3多蛋白复合物的形成,并触发NHE3以一种依赖于Rho GTP酶的持续活性的方式转变为根尖膜上内化的、可移动的NHE3亚群[26]。

大多数NHE3内吞通过网格蛋白和白蛋白依赖性过程发生。网格蛋白(Clathrin-mediated endocytosis,CME)介导的内吞作用是最独特的内吞作用机制,是上皮细胞吸收大分子的主要途径,NHE3-Clathrin依赖复合物的内化途径主要通过Ca2+结合蛋白Syt I与肠上皮NHE3结合后,依靠AP2和网格蛋白募集激活胞吞所需的网格蛋白的组装,介导cAMP和Ca2+诱导的胞吞[76-77]。NHE3的白蛋白内吞作用需要形成包含许多跨膜蛋白和辅助蛋白的大型蛋白复合体,其复合体可能包括辅助蛋白,如支架蛋白NHERF1和NHERF2的PDZ基团。

5.3 激酶激活和细胞骨架的运输

NHE3的C端细胞质结构域包含多个假定的磷酸化位点,蛋白激酶磷酸化可以调节NHE3的部分信号转导;其C端也能够与大量的细胞和结构蛋白相互作用,与肌动蛋白细胞骨架附着后有助于NHE3的顶端保留。NHE3通过细胞骨架的运输主要包括cGMP和cAMP两种酶的激活。其中,多巴胺(DA)、甲状旁腺激素(PTH)、血管活性肠肽、分泌素和肠毒素(如霍乱毒素)激活腺苷酸环化酶,可迅速提高肠道cAMP水平,具体来说,位于F-actin中的Ezrin与NHERF1或NHERF2和cAMP依赖蛋白激酶II型(PKAII)结合,定位PKAII,使其能够磷酸化NHE3,从而抑制其活性[78]。与cAMP作用机制不同的是,cGMP对NHE3的作用似乎完全通过激活刷状缘中的cGMP依赖性蛋白激酶II型(cGMP-dependent protein kinase II,cGKII)来实现,cGKII的N端附着在质膜上,C端与NHERF2 的PDZ结构域2结合,使环GMP能有效抑制NHE3。Donowitz等[79]验证了附着在PDZ2上的是细胞骨架连接蛋白(ezrin-radixin-moesin,ERM)结合结构域,通过该结构域,Ezrin一方面将NHERF1和NHERF2连接到肌动蛋白细胞骨架,另一方面分别结合PKAII和cGKII,PKAII与Ezrin结合后直接引起NHE3磷酸化,而cGKII必须与PDZ2-COOH末端结合和通过豆寇酰化直接固定在上皮刷状缘上。NHE3以复合物和动态大分子的形式既直接又间接与Ezrin结合,Ezrin不仅与NHERF和PKA结合,也通过其C端结构域与肌动蛋白结合,且含有PDZ结构域的蛋白调节因子NHERF1和NHERF2作为连接NHE3和Ezrin的中间体,对于NHE3调节的许多方面都是必需的。

Han等[80]为了确定二甲双胍介导的NHE3调节机制,通过5′-AMP活化蛋白激酶激活剂模拟二甲双胍,发现二甲双胍增加了NHE3的磷酸化和泛素化。Stephens等[81]的研究用毛喉素和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤刺激细胞内cAMP导致野生型小鼠远端回肠和盲肠中草酸盐净分泌增加,并抑制盲肠和远端结肠中的钠吸收,而试验组小鼠cAMP对草酸盐分泌的刺激被削弱,这表明NHE3可能在cAMP刺激草酸盐过程中发挥作用。

5.4 相关活化信号激活NHE3易位

NHE3从内体转移到质膜主要通过各种质膜活化信号激活细胞骨架蛋白后将微腔中的NHE3运输到质膜上。当受到某些信号的刺激时,如SGLT1活性的增加、EGFR信号、Ca2+浓度的升高以及与PAK相关转换因子β(PAK-interacting exchange factorβ,βPix)和锚蛋白重复域2(ankyrin repeat domains 2,Shank2)蛋白的结合,NHE3将从再回收内体转运回质膜的顶端。其激活路径分别如下:1)SGLT1/P38AMP/MAPMAPK2/PI3K/AKT2/Ezrin通路激活NHE3;2)EGFR/RhoA/RoCK/RSK2途径调控NHE3;3)Ca2+/CaMK II依赖途径介导ANG II对NHE3的激活; 4)βPix通过Shank2介导的蛋白-蛋白相互作用上调NHE3[82]。

5.5 脂筏和膜曲率调节NHE3活性

除了磷酸化、支架和运输之外,还有另一个级别的急性NHE3调节:其活化动力学可以通过质膜的曲率来调节[84]。这种通过脂筏而不依赖与网格蛋白来调控NHE3活性的方法,是另一种在质膜内划分NHE3的依据。脂筏主要在NHE3内吞过程中发挥作用,且可能近一半的表面NHE3位于脂筏中,并且Zachos等[84]证明了卡巴胆碱介导的NHE3内吞是通过脂筏和活化的Cdc42依赖性途径发生,不涉及网格蛋白。NHE3的活性和转运依赖的这些脂筏,可能对NHE3的膜信号转导、转运和转运活性的时机非常重要。

综上所述:NHE3的调控机制与路径包括:1)在Ca2+、cGMP和cAMP依赖性信号通路的刺激时,NHE3结合物经历一系列复杂的动态变化,将稳定的NHE3亚群转化为可移动的亚群;2)随后主要通过包合蛋白/白蛋白中介途径转移至高尔基体和内质网中再处理后转移到再回收内体;3)当循环核小体中的NHE3受到质膜活化信号的刺激时,例如Ca2+/Ezrin/RSK2/Shank2,它会迁移到质膜上并重新固定在细胞骨架上,形成NHE3的稳定亚群,从而发挥氢和钠交换的生理活性(图2)。

图2 NHE3信号通路图(修改自文献[82])

6 小结与展望

NHE3 是调节水盐重吸收和酸碱平衡的主要亚型,在过去的几十年中,关于NHE3 在腹泻中的研究已经取得了显著的进展。作为胃肠道中Na+/H+的重要交换器,当受到细菌、病毒和毒素等病原的感染后,其活性受到抑制,肠道中的Na+转运出现障碍,同时水和电解质等将潴留导致腹泻的发生[85]。在任何情况下,NHE3并不是以单体的形式存在,而是以复杂、动态变化的大分子复合物的形式存在。这种多蛋白复合物在上皮刷状缘和细胞内隔室之间循环运动是调节NHE3活性的一种手段,并且NHE3的活性调控包括从上皮质膜顶端到细胞内体循环、转录和翻译调控、蛋白质之间的动态相互作用、以及相关信号通路的调控等多种机制。这些在各个层面的复杂调节,具有巨大的治疗开发潜力。从理论上讲,每个调节步骤都可以作为治疗靶点。腹泻病动物可能受益于NHE3活化,而NHE3抑制有助于减轻便秘现象,且NHE3在急性肾损伤和高血压等疾病中也有重要作用。但目前关于NHE3的研究依然较为局限,所以更加综合地研究其相关功能、调控机制是必须的,这也将为诸多与腹泻、高血压和肾脏方面等相关的疾病提供新的治疗途径和思路,具有重要的理论意义和实践意义。