羊腹泻样本中大肠杆菌的分离、毒力基因与耐药性分析

刘鑫欢,恽佳蕾,毛 立,李基棕,郝 飞,何苗锋,,杨蕾蕾,张纹纹,程子龙,孙 敏,刘茂军,,3,5,王少辉,白 娟,李文良,,3,,5*

(1.南京农业大学动物医学院,南京 210095;2.江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室,南京 210014;3.江苏大学食品与生物工程学院,镇江 212013;4.中国农业科学院上海兽医研究所,上海 200241;5.兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心,泰州 225300)

大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)为革兰阴性菌,呈短杆状,主要引起动物和人发生胃肠道感染,导致腹泻,有的菌株还会导致尿路或局部组织感染[1]。肠道致病性大肠杆菌对养殖业危害最为普遍,主要包括产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigencE.coli,ETEC)、产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin-producingE.coli,STEC)、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicE.coli,EPEC)和肠侵袭性大肠杆菌(enteroinasiveE.coli,EIEC)等[1]。羊感染肠道致病性大肠杆菌后主要出现腹泻、消瘦等症状,严重者出现败血症、休克死亡[2]。此外,牛羊等反刍动物是STEC的携带者,STEC对人畜都具有较强的感染能力,传播途径广泛,经由养殖-加工产业链传播的风险很高,造成巨大的公共卫生威胁[1,3]。除了O157:H7 型,研究者也越来越重视非 O157 型STEC的监测[4-7]。

近十余年来,华东地区养羊业快速发展,形成以自繁自养和异地育肥模式为主的规模化肉羊养殖产业。但伴随着规模化集约化养殖,羊病呈多发且普遍流行趋势,由大肠杆菌引起的疾病较为常见[8]。同时,兽医临床上抗菌药的不规范不合理使用造成大肠杆菌耐药性日益严重。在不同类型抗菌药物持续作用压力下,耐药质粒在菌株间发生结合与传递,导致多重耐药性(multi-drug resistance,MDR)[9]。耐药性的日益增强以及MDR菌株的出现对大肠杆菌病的防治及公共卫生安全带来极大的威胁[10]。现有研究报道表明部分省区羊源大肠杆菌的检出率和耐药性都普遍较高[11-13]。但与猪禽等来源的大肠杆菌相较,羊源大肠杆菌流行菌株特性的研究报道仍相对较少,且毒力基因、耐药性等特性存在地区差异,尤其对华东地区羊源大肠杆菌的相关报道十分缺乏。因此本研究对华东地区四个省份规模化羊场腹泻源大肠杆菌感染情况进行调查研究,并对分离菌株进化分群、毒力基因、耐药性进行检测分析,为深入开展流行病学、病原学研究和该病的防治提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 临床样品

样品于2015—2021年采集自华东地区四省(江苏、安徽、浙江、江西)发生腹泻的肉羊养殖场病死羊肠道组织或粪便拭子(共计187份),采集后冷藏保存,24 h内用于细菌分离。

1.2 试 剂

通用型柱式基因提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司;2×Rapid Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司;DNA 分子量标准DL2000购自北京全式金生物科技有限公司;麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、革兰氏染液购自青岛海博生物试剂有限公司;药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离鉴定

将新鲜粪便拭子置于1.5 mL离心管中,加入1 mL无菌PBS浸泡稀释30 min。在无菌环境中吸取浸泡管中PBS 100 μL于麦康凯培养基上涂布均匀。肠道组织样品表面灭菌处理后,在无菌环境中剪开,接种环刮取肠黏膜,划线接种于麦康凯培养基。接种后的培养板置37 ℃培养箱培养16～18 h后挑取淡粉色光滑菌落,于伊红美蓝培养基上划线分离纯化。37 ℃恒温度培养16～18 h后,选择培养皿上符合大肠杆菌菌落生长特点(黑色、金属光泽)的单菌落挑取,接种于LB培养基中37 ℃中振荡培养16～18 h。对分离菌株进行革兰染色镜检;同时使用16 S rRNA引物[14],进行菌液PCR扩增。PCR反应体系为20 μL:模板(新鲜培养的菌液)2 μL,2×Mix 10 μL,上下游引物各1 μL(10 μmol·L-1,引物由北京擎科生物科技有限公司合成),ddH2O 6 μL。PCR反应条件:95 ℃ 预变性3 min;95 ℃变性15 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像系统观察后,切取符合目的片段大小的PCR产物,送生工生物工程(上海)股份有限公司测序并对测序结果进行BLAST对比分析。每份样品挑取的2个单菌落进行测序鉴定,结果完全相同的判定为同一株菌,有差异的判为两株菌。每株菌均分装冻存于-40 ℃。

1.4 大肠杆菌系统进化群鉴定

按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取大肠杆菌分离株DNA。以提取的DNA为模板,根据参考文献[15]使用chuA、yjaA、TspE4.C2的3对系统进化分群基因引物(引物由北京擎科生物科技有限公司合成)按照“1.3”的反应体系和反应程序进行扩增,并依据检测结果按照文献[15]中的判定标准对大肠杆菌菌株进行分群。

1.5 大肠杆菌毒力基因鉴定

按照参考文献[16-20]合成检测大肠杆菌毒力基因的引物,对大肠杆菌分离株所携带的papC、tsh、mat、ibeB、yijp、vat、iss、cvaC、ompA、neuA、chuA、fyuA、irp2、iroN、afa、draB、hlyA、stxl、stx2、eae、LT、Sta、STb、fimC、aatA、iucD、crlA、iha、cnf1/2、F17b及F17c等31种毒力基因进行检测,按照“1.3”的反应体系和反应程序进行PCR扩增,根据不同引物对的Tm值调整退火温度。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。根据结果分析各毒力基因检出率及其与进化群的分布关系。

1.6 大肠杆菌药敏试验

选取青霉素类(氨苄西林、阿莫西林)、头孢菌素类(头孢呋辛、头孢曲松)、碳青霉烯类(亚胺培南、美罗培南)、氨基糖苷类(链霉素、阿米卡星、庆大霉素、大观霉素、卡那霉素)、磺胺类(复方新诺明)、四环素类(多西环素)、氟喹诺酮类(诺氟沙星、恩诺沙星)、多肽类(多黏菌素B)共8大类16种抗菌药,采用圆盘扩散试验(K-B法)鉴定大肠杆菌分离株的抗菌药敏感性。根据药敏纸片使用说明书和CLSI的标准和建议,分别以R(耐药)、I(中介)、S(敏感)对其耐药性进行评价。分析每种药物和每类药物的耐药比例并统计多重耐药菌株分布情况。

2 结 果

2.1 细菌分离鉴定

经过分离、纯化和测序鉴定,共计从187份临床样品中分离到163株大肠杆菌,分离率为87.17%。分离所得大肠杆菌菌株在麦康凯培养基上生长形态为粉红色光滑的圆形菌落,在伊红美蓝培养基上生长形态为黑色并有金属光泽菌落。经革兰染色后,显微镜下观察菌落形态为两端钝圆革兰阴性杆菌。测序结果通过NCBI进行Blast对比分析,与大肠杆菌16 S rRNA基因序列相似性达到99%～100%。

2.2 系统进化群鉴定

根据PCR扩增结果分析,分离的163株大肠杆菌中,属于系统进化群B1群的菌株最多(n=97),占比59.51%。其次为A群,检出率为28.83%,D群的检出率为9.82%,B2群的检出率最低,为1.84%(图1)。

图1 大肠杆菌分离株系统进化分群分布情况

2.3 毒力基因检测分析

对分离到的163株大肠杆菌进行31种毒力基因的检测。结果如图2所示,yijp、crlA、mat、ompA、fimC、ibeB6种毒力基因的检出率均>80%,分别为99.39%、98.77%、95.71%、91.41%、87.73%、87.73%。其次,eae、stx2、iucD、iss、fyuA、irp2、iroN、ibeA、aatA的检出率分别为57.67%、42.33%、41.10%、33.13%、31.29%、26.38%、20.86%、14.11%、12.27%。chuA、cva/cvi、hlyA、neuC、F17c、papC、Sta、stx1、vat、F17b、tsh、iha、cnf1/2、STb这14种毒力基因的检出率在10%以下。所有菌株中均未检出afa/draB和LT毒力基因。163株大肠杆菌平均毒力基因数量为8.93。stx1和stx2这两个毒力基因是STEC鉴定的重要靶点,存在stx1或stx2毒力基因的菌株定义为STEC菌株。本试验163株分离菌株中,有72株菌属于STEC。72株STEC中编码毒力基因同时含有stx1和stx2的菌株有1株,只含stx1或stx2 的菌株数分别3株和68株;其中B1群有52株,A群中有15株,D群与B2群中分别有4株和1株;B1群菌株占72.22%,为优势群(图3)。STEC另一标志性毒力基因eae在72株STEC中检出率为61.11%(44/72)。

图2 大肠杆菌毒力基因总检出率(总菌株数,n=163)

2.4 大肠杆菌毒力基因与系统进化群间相关性

毒力基因在各进化群分布热图显示(图4),fimC、mat、crlA、ibeB、yijp及ompA基因在腹泻源大肠杆菌各群间均广泛分布。eae、fyuA、iucD、stx2、irp2和aatA在各群中也均有分布,但检出率较低。此外,fyuA在B2群和D群中占优势,iucD在A群和D群占优势,aatA和F17b在B2群中占优势,iss和stx2在B1群居多。B1群中菌株平均携带8.82个毒力基因,略低于总体平均水平;A群和D群菌株平均携带9.29和9.69个毒力基因;B2群菌株平均毒力基因个数最多,为10.33个。

2.5 大肠杆菌耐药性检测

163株大肠杆菌分离菌株对受试药物表现出高度耐药(图5)。16种受试抗菌药中有4种的耐药率大于80%,包括多西环素(89.57%)、氨苄西林(86.50%)、恩诺沙星(85.28%)、复方新诺明(81.60%)。分离菌株对四环素类、青霉素类、磺胺类耐药率均大于80%;对氟喹诺酮类药物耐药率为74.85%～85.28%;对氨基糖苷类药物耐药率为45.40%～72.39%;对头孢菌素类药物耐药率为57.67%～66.87%;对多肽类(多黏菌素B)耐药率相对较低,为57.06%。此外,在本次药敏试验中发现分离菌株对碳青霉烯类的亚胺培南和美罗培南也表现出耐药,耐药率分别为11.04%和10.43%。

除较高的耐药性检出率,分离的大肠杆菌中对10种及以上药物耐药的占67.48%(110/163)。在163株菌株中92.02%菌株对3～8类抗菌药耐药,属于MDR菌株。大部分菌株表现为五重及以上耐药(84.05%,137/163);七重耐药菌株最多,达34.36%,其次为六重耐药菌,占29.45%;本次分离菌株中对所有八类药物都耐药的菌株数为12株,占7.36%(图6)。

3 讨 论

大肠杆菌作为引发人畜腹泻性疾病的重要病原,对养殖业健康发展和公共卫生安全造成巨大威胁。随着我国规模化养羊业的快速发展,大肠杆菌引发的疾病在临床越来越普遍且造成了较大的经济损失。为了解当地羊群大肠杆菌的感染情况,国内部分学者对当地羊源大肠杆菌开展流行病学调查。但由于各地环境气候及养殖模式的差异,大肠杆菌的流行情况也存在差异。西藏那曲市(28.3%)和甘肃省(38.89%)羊源大肠杆菌总体分离率相对较低[2,21]。而宁夏回族自治区(91.0%)、青海高原牧区(88.9%)和陕西省(92.59%)的分离率普遍较高[11,22]。宋晓莉等[13]对江苏地区羊源大肠杆菌进行检测,总分离率为74.67%(56/75)。本试验对华东地区4个省份腹泻羊源大肠杆菌检测,总分离率为87.17%,与上述宁夏、青海、陕西地区的分离率接近,这说明大肠杆菌在本地区羊场腹泻疾病中扮演重要角色。上述报道均未对分离菌株进行进化分群分析,本研究对163株分离株进行进化群分析发现B1群最多,B1和A群共占88.34%(144/163),这与国内外研究报道对羊源大肠杆菌分离株进行鉴定,B1为优势群的结论一致[23-25],也与猪源、牛源大肠杆菌的优势进化群为A群或B1群的报道一致[26-28]。

大肠杆菌的致病性与其携带毒力基因种类和数量密切相关。本研究对分离的163株大肠杆菌进行31种毒力基因的检测,除afa/draB和LT,其余毒力基因均有检出,平均毒力基因数量为8.93个。fimC、mat、crlA、ibeB、yijp及ompA这6个黏附、侵袭相关的毒力基因检出率均大于80%,且在各进化群菌株中均广泛分布。研究表明yijp和ibeB基因在大肠杆菌引发脑膜炎的发病机制中也发挥重要作用[29]。irp2是参与耶尔森强毒力岛(high pathogenicity island,HPI)合成的主要毒力基因之一,与fyuA共同调节大肠杆菌的致病性[30]。本研究中这两个毒力基因检出率分别为31.29%和26.38%。根据毒力基因检测结果,在本次分离的大肠杆菌中发现72株STEC(44.17%)。这与新疆(42.86%)、宁夏地区(53.7%)羊源STEC检出率相似[31-32]。相关报道对羊源STEC研究中stx1检出率均高于stx2[4,23,33]。然而在本研究中,72株羊源STEC菌株stx2的检出率为42.33%,明显高于stx1(2.45%)。此外,由eae基因编码的紧密黏附素在STEC发病机制中起着关键作用[5]。本研究中STEC中的eae毒力基因的检出率为61.11%,远远高于国内外报道的检出率[4,6,23,33]。这可能与样品来源和种类不同有关(本研究菌株均分离自发生严重腹泻病死羊肠道或粪便),需要更进一步研究证实。上述毒力基因及STEC菌株的高检出率提示应重视羊源大肠杆菌的监测及其对公共卫生的威胁。

细菌耐药性一直是威胁健康养殖和公共卫生安全的巨大问题。随着肉羊规模化养殖的发展,抗菌药物的使用也越来越普遍[25]。本研究中,163株大肠杆菌对16种受试抗菌药平均耐药率为63.54%,有13种药物的耐药率大于50%,4种大于80%。复方新诺明和多西环素的耐药率与杨跃飞等[34]对江苏及周边地区送检的病(死)动物病料中分离到的大肠杆菌耐药比例以及宋晓莉等[13]对羊源大肠杆菌的检测结果相近。分离菌株对治疗MDR菌感染的“最后一道防线”——多黏菌素B的耐药率也达57.06%;对碳青霉烯类药物的耐药率范围为10.43%～11.04%,都显著高于先前的同类报道[11,25,31-32]。这对公共卫生安全带来了严峻的挑战。近些年来,细菌多重耐药的情况也越来越严重。赵学亮等[11]检测陕西省部分地区腹泻羊源致病性大肠杆菌中98%为MDR菌株。冯杰等[32]检测宁夏羊源大肠杆菌耐药性发现27.59%(16/58)的分离株为MDR菌株。恽佳蕾等[8]检测了49株分离自病羊肺的大肠杆菌,均为MDR菌株。本研究发现92.02%的菌株属于MDR菌株,大部分菌株表现为五重及以上耐药(84.05%,137/163),有12株菌对所检测的8类药物均耐药。这表明华东地区羊源大肠杆菌耐药性普遍且严重,加强对肉羊养殖环节大肠杆菌耐药性的研究和科学用药指导十分重要和迫切。

4 结 论

随着规模化养羊的快速发展,频繁地调运、薄弱的生物安全措施和不科学的用药技术加剧了大肠杆菌及相关疾病的传播和危害性。本研究表明大肠杆菌在江苏、安徽、浙江、江西发生腹泻羊群中具有很高的流行率,分离菌株毒力基因种类多样、耐药性强,多重耐药菌株和STEC占比较高。有必要对羊源致病性大肠杆菌的流行情况进行持续的调查研究,为深入开展流行病学、病原学研究和羊场大肠杆菌病的防治提供基础和参考。