生产母兔沙门菌感染的病理学变化及其药物敏感性分析

张倩文,刘玉梅,石丽辉,梁文军,李梦云,王玉琴,张自强*

(1.河南科技大学动物科技学院,洛阳 471000;2.南阳中农高盛生物工程有限公司,南阳 473300)

兔沙门菌病是由沙门杆菌引起的一种细菌性传染病。临床上多表现为出血性败血症,也可引起发病动物出现腹泻及孕母畜流产等症状[1-2]。有研究发现,生产母兔沙门菌感染率为30.30%～73.33%[3],败血症和流产是导致母兔死亡的主要原因[4]。患病兔有内脏器官充血或有出血斑,子宫粗大,黏膜表面有脓性分泌物的特点[5],各器官容易发生不可逆病变而加重细菌感染。沙门菌属于机体正常寄居菌,当某种因素打破体内细菌的生存平衡时或者环境中出现大量致病菌时,会诱使细菌大量生长和繁殖,使动物出现炎症,引发疾病,从而产生较高的死亡率[6-9]。

妊娠母兔免疫系统较弱,自身恢复能力有限,易受外界环境影响,妊娠期间母兔营养水平要求较高,同时,也易感染传染性疾病,如大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、病毒性出血症病毒等,造成流产和死亡[10-11],但均未有进一步的组织学病理研究,而对母兔感染沙门菌的组织病理学变化更是鲜有报道。本研究在宏观和微观角度观察沙门菌感染孕母兔引起的病理学特征,并通过药物敏感性试验确定沙门菌对16种常用抗生素的耐药谱,对该致病菌感染的防治、科学用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 患病动物临床症状及主要试剂仪器

患病来自河南某规模化种兔场,为妊娠天数为25～30日的经产母兔,患病兔死亡前每次主要疫病(兔病毒性出血症、兔球虫、兔大肠杆菌、兔多杀性巴氏杆菌等)的例检均为阴性。该兔场妊娠母兔发病率为40%,死亡率为50%。患病母兔出现精神沉郁、呼吸短促、呼吸声音重、便血、发热、腹泻严重、难产、食欲下降、流产、阴门红肿等临床症状。

麦康凯琼脂培养基购自海博生物技术有限公司、药敏纸片购自温州康泰生物科技有限公司。多聚甲醛购自天津市丰华化学试剂厂。沙门菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司。细菌基因组DNA小量提取试剂盒、DL2000 DNA Marker购自南京诺唯赞科技有限公司。主要仪器包括摊片机(KD-P),烘片机(KD-H),微波炉(P70D20TL-P4),PCR仪(Applied Biosystems)等。

1.2 患病动物剖检及样品采集

剖检患病母兔6只,健康母兔3只,观察母兔的病变情况。按照常规剖检程序对患病和健康母兔进行无菌剖检,观察病兔组织器官剖检变化,分别取心、肝、脾、肺、肾、子宫组织于培养基中进行培养,并取取心、肝、脾、肺、肾组织于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.3 病原菌的分离、血清型鉴定与分子生物学鉴定

无菌条件下取病兔心、肝、脾、肺、肾、子宫等组织,接种于普通琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基,置于培养箱中培养。挑取单菌落涂片染色,镜检并纯化。勾取纯化后的菌落进行血清型鉴定,通过观察菌体涂片在生理盐水中是否有凝集现象排除菌体的自凝性,后进行菌体抗原 O的血清凝集性试验,确定沙门菌的血清型。取纯化后的菌落按照细菌基因组提取试剂盒说明书的步骤进行抽提,将其作为PCR扩增模板,参照亓玉卓等[12]的PCR方法扩增,所得PCR产物进行凝胶电泳并测序鉴定,引物序列见表1。

1.4 病兔组织病理学观察

取病兔心、肝、脾、肺、肾组织固定于4%多聚甲醛中。组织经 70%、80%、90%、95%、100%无水乙醇中逐级脱水。之后进行组织块透明和石蜡包埋,将包埋好的组织块切成 5 μm 切片并烘干。室温下,将切片进行苏木精-伊红染色,染色后的切片使用不同浓度无水乙醇脱水,切片透明并封片。使用显微镜采集照片。

1.5 动物致病性试验

取分离菌株培养液(浓度为109CFU·mL-1)对小鼠进行致病性试验,验证分离菌株的致病性。取8只KM小鼠(20 g左右,SPF级)随机分为2组,每组4只,第一组小鼠每只腹腔注射0.2 mL菌液(沙门菌处理组),第二组小鼠每只注射0.2 mL生理盐水(对照组)。相同环境下饲养,记录发病情况,对病死小鼠剖检。

1.6 病原菌药物敏感性分析

使用κ-B法(纸片扩散法)对分离菌进行抗生素药物敏感性检测,抗生素纸片包括氟苯尼考、丁胺卡那、头孢哌酮、哌拉西林、头孢他啶、头孢曲松、氯霉素、复方新诺明、氧氟沙星、庆大霉素、头孢氨苄、氨苄西林、恩诺沙星、环丙沙星、四环素、多黏菌素B。

2 结 果

2.1 患病兔剖检状况观察

剖检病兔各组织器官均出现明显症状。共剖检发病母兔6只,剖检发现致病菌感染怀孕母兔后,多数器官出血,并伴有一定程度的坏死,但不同器官组织的病理损伤程度不同。剖检结果显示,患病兔心包黏连,严重者见心包和心难以分离;肺见淤血、严重出血、肺表面有纤维素性渗出,形成灰白色结节;肝变性,有灰黄色坏死小点或灰白色结节;脾呈暗红色;肠道黏膜呈卡他性炎症;病兔子宫内有木乃伊胎,子宫肿胀,有脓性渗出物,子宫壁增厚,黏膜上有大量出血点。

2.2 病原菌分离、血清分型及PCR鉴定

在6只发病母兔的心、肝、脾、肺、肾和子宫处均分离得到致病菌。分离菌在普通培养基上形成灰白色、中等大菌落(图1A),在麦康凯平板上培养形成无色透明或半透明圆形小菌落(图1B)。革兰染色结果显示,分离菌在镜下呈粉红色、卵圆形(图1C)。之后进行血清学分型O抗原鉴定,结果显示,分离菌株均出现凝集现象,初步表明分离菌是沙门菌。以纯化病原菌提取的细菌DNA为模板,进行PCR反应,发病兔分离纯化得到的细菌均在1 494 bp处出现条带(图2)。将扩增产物进行测序,序列经NCBI(Blast)数据库进行比对分析,与沙门菌序列相似度较高。同时构建遗传进化树(图3),结果显示,从6只发病母兔各器官中分离得到的病原菌与登录号为CP054898.1的沙门菌同源性为99.71%。表明患病母兔感染的是沙门菌。

A.普通固体培养基沙门菌的菌落形态;B.麦康凯固体培养基沙门菌的菌落形态;C.沙门菌革兰染色

图3 沙门菌16S rRNA基因系统发育树

2.3 动物致病性试验

用分离纯化病原菌对小鼠进行致病性试验,结果显示,第1组沙门菌处理小鼠在24 h内全部死亡,第2组小鼠正常(对照组)。剖检病死小鼠发现,沙门菌处理组小鼠肝组织边缘发黑,表面有纤维素性坏死物,肿大;肺布满出血斑;脾淤血、肿大;胃、肠黏膜透明,胃内容物发黄,肠内容物发绿。取死亡小鼠肺、肝、脾、肠组织接种普通固体培养基,分离的菌落特征和染色镜检结果均与原分离菌株一致,经分子生物学鉴定发现鼠分离株与原菌株相同。结果表明,沙门菌对动物具有致病性和致死性。

2.4 组织病理学变化观察

制作沙门菌感染母兔和健康母兔组织器官的石蜡病理切片,进行组织病理学观察。结果显示,病兔心肌纤维弯曲、排列紊乱,有断裂,间质水肿,红细胞浸润,肌浆中出现蛋白质颗粒或空泡(图4A、B);肝细胞颗粒变性、脂肪变性,成大量空泡状,窦状隙变窄,部分区域淤血,在小叶内显示局部坏死,有少数淋巴细胞及异嗜性细胞浸润,胆管周围的毛细血管严重充血(图4C、D)。脾组织出现明显淤血、出血,白髓中淋巴细胞明显增多,网状细胞增生,可见坏死灶;红髓中充满巨噬细胞,还有较多含铁细胞,窦内皮细胞增生,充满大量红细胞,红白髓界限不清(图4E、F)。病兔肺组织广泛淤血,肺泡壁结构几乎消失,细支气管上皮细胞变性、坏死、脱落,管腔中有中性粒细胞和脱落的上皮细胞(图4G、H)。病兔肾小球充血、肿胀;毛细血管扩张充血;肾小管上皮细胞颗粒变性、水泡变性(图4I、J)。

结果表明,沙门菌感染使得母兔器官发生明显组织病理学变化,以各器官组织红细胞浸润,血管充血,细胞颗粒或脂肪变性为主要病理学特征。

2.5 分离菌药物敏感性

药物敏感性试验结果表明,沙门菌对头孢哌酮、哌拉西林、头孢他啶、头孢曲松、氯霉素、复方新诺明、氧氟沙星、庆大霉素、头孢氨苄、氨苄西林、恩诺沙星、环丙沙星、多黏菌素B1、四环素共15种药物表现出敏感性,对丁氨卡那未出现敏感性。表明沙门菌分离株对大部分革兰阳性菌和阴性菌的抗生素和广谱抗生素均敏感,对丁胺卡那耐药可能与其在兔场频繁使用有关。

3 讨 论

动物受到外界条件变化影响,抵抗能力下降,抗沙门菌能力减弱时,容易引发沙门菌病[13-15]。刘照波等[16]研究发现,发病兔通过粪口或垂直传播,引起兔群发生沙门菌病,且传播速度较快,病死率较高,并且伴有腹泻症状。李欣[17]以发热、腹泻、妊娠母兔流产、死亡为特征的病兔为研究对象,发现沙门菌是造成妊娠母兔死亡的主要原因。本研究中,从流产病兔心、肝、脾、肺、肾、子宫处分离得到疑似病原菌,经过细菌形态和特种培养基鉴定,结合临床症状及病理变化特点,初步判断为为沙门菌。后经血清分型、PCR鉴定及沙门菌同源性分析,确定引起妊娠母兔出现流产症状的的病原菌为沙门菌。

表2 分离菌药物敏感性试验结果统计表

本研究观察发现,与健康母兔相比,沙门菌感染母兔后,机体器官系统发生出血病变,以肺和肝的病变最为显著。当沙门菌感染机体时,不仅会导致生殖系统异常、功能障碍,还会造成全身器官系统的结构损伤、机能异常[18-20]。谭烁等[21]研究发现,小鼠感染肠炎沙门菌后,主要组织器官出现肿大、坏死、细胞空泡变性、炎性细胞浸润。刘俊伟等[22]研究发现,感染沙门菌猪的各内脏器官表现为败血症,肝组织细胞内炎性细胞浸润,形成副伤寒结节。有研究表明,鸡产出死胎或未足月胎儿、胚胎溶化、子宫内膜炎等都可加重败血症,从而继发心、肝、脾、肺、肾等器官淤血和组织变性[23]。在本研究中,发病母兔阴门出血,子宫黏膜充血、水肿,内膜表面脓性渗出物、溃疡,出现流产和胎儿液化,组织学观察发现母兔肺淤血、有出血斑,脾淤血肿大,肝表面有大小不一的不规则灰白色坏死灶,表明沙门菌能够引起母兔各器官出现病变,并降低母兔繁殖性能。

生殖器官不同程度的坏死是妊娠母兔感染沙门菌的常见病症。已有研究表明,引起繁殖母兔流产死亡的病因可分为传染病性疾病和机械物理性两种类型[24]。董文秀[25]研究认为,沙门菌可使妊娠母兔发生化脓性子宫炎、子宫黏膜溃疡,子宫颜色发黑为主的病理特征。至今,有关妊娠母兔沙门菌感染的组织病理特征鲜见报道。本研究对沙门菌引起的妊娠母兔病理组织进行观察,发现患病母兔心、肝、脾、肺、肾组织细胞间隙均充满红细胞,心肌细胞排列紊乱,肝细胞水泡和脂肪变性,脾血管内皮细胞肿胀明显;肺泡壁的毛细血管扩张。

由于沙门菌的分型较多,临床上尚无有效的菌苗进行治疗[26-28]。因此,目前沙门菌感染主要采用抗生素进行治疗,但由于临床上长期滥用抗生素,致使沙门菌出现严重的多重耐药现象。刘芳萍等[29]发现,鸡源沙门菌对头孢唑啉、卡那霉素、庆大霉素4种抗菌药物高度敏感,对四环素、氨苄西林、复方磺胺、喹诺酮类、磺胺等抗菌药物耐药率均较高。李珂等[30]检测鹅源沙门菌的药物敏感性显示,其对磺胺类、阿米卡星、卡那霉素、β-内酰胺有较低敏感性。本研究药敏试验结果表明,沙门菌对丁氨卡那(氨基糖苷类)抗生素不敏感,而对氯霉素类、头孢菌素类、青霉素类、喹诺酮类、四环类、多肽类、β-内酰胺、磺胺类抗生素具有较高的敏感性,可作为临床用药的依据。因此,当兔场发生该病时,根据药敏试验结果指导科学用药,才能获得良好的治疗效果。在进行药物防治的同时,也要注意制定合理的管理措施,只有树立科学的用药观念,合理规范用药并加强饲养管理,才可有效的预防沙门菌感染,减少细菌感染对兔养殖的危害。

4 结 论

本研究从病兔组织中分离出革兰阴性菌,经分离培养、序列分析等确定为沙门菌,并对病兔组织进行组织病理学观察。经药物敏感性试验检测发现分离的沙门菌对头孢哌酮等15种药物敏感,对丁胺卡那有耐药性,为沙门菌的合理防治提供了科学参考。