去亚甲基小檗碱对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡的影响

2023-08-26 01:15朱天立孙琳王炳超马泽刚
青岛大学学报(医学版) 2023年3期
关键词:小檗多巴胺比值

朱天立 孙琳 王炳超 马泽刚

[摘要]目的探討去亚甲基小檗碱(DMB)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡通路的影响。方法培养SH-SY5Y细胞,将其分为对照组、MPP+组、小檗碱(BBR,DMB的前体)+MPP+组、司莱吉兰(selegiline,与DMB同为单胺氧化酶B抑制剂)+MPP+组、DMB+MPP+组。应用免疫印迹法检测各组bcl-2/bax比值以及cleaved caspase-3蛋白的表达。结果与对照组相比,MPP+组bcl-2/bax比值明显降低(F=42.58,q=17.89,P<0.001),DMB、BBR、selegiline处理均可以抑制MPP+诱导的bcl-2/bax比值降低(q=6.71~10.63,P<0.001),且selegiline处理效果强于BBR和DMB(q=3.93、3.59,P<0.05)。与对照组相比,MPP+组cleaved caspase-3蛋白表达明显上调(F=111.60,q=29.44,P<0.001),DMB、BBR、selegiline处理可以降低MPP+诱导的cleaved caspase-3蛋白表达上调(q=10.74~13.53,P<0.001),且3种药物处理效果差异无显著性。结论对于MPP+诱导的SH-SY5Y细胞,DMB可以升高bcl-2/bax比值,降低cleaved caspase-3蛋白的表达。

[关键词]小檗碱;SH-SY5Y细胞;线粒体;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3;细胞凋亡

[中图分类号]R338.2[文献标志码]A[文章编号]2096-5532(2023)03-0375-04

doi:10.11712/jms.2096-5532.2023.59.095[开放科学(资源服务)标识码(OSID)]

[网络出版]https://link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230804.1522.005;2023-08-0417:38:52

EFFECTS OF DEMETHYLENEBERBERINE ON MITOCHONDRIAL CASPASE-DEPENDENT APOPTOSIS IN SH-SY5Y CELLS INDUCED BY MPP+ZHU Tianli, SUN Lin, WANG Bingchao, MA Zegang (Department of Physiology, School of Basic Me-dicine, Qingdao University, Qingdao 266071, China)

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effects of demethyleneberberine (DMB) on the mitochondrial caspase-dependent apoptosis pathway in SH-SY5Y cells treated with 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+). MethodsSH-SY5Y cells were cultured and divided into control group, MPP+ group, berberine (BBR, the precursor of DMB)+MPP+ group, selegiline (a monoamine oxidase B inhibitor similar to DMB)+MPP+ group, and DMB+MPP+ group. The ratio of bcl-2/bax and the expression of cleaved caspase-3 protein were determined by Western blot for each group. ResultsCompared with that in the control group, the bcl-2/bax ratio in the MPP+ group was significantly lower (F=42.58,q=17.89,P<0.001). DMB, BBR, and selegiline all significantly inhibited the MPP+-induced decrease in the bcl-2/bax ratio (q=6.71-10.63,P<0.001), and the effect with selegiline was significantly greater than that with BBR (q=3.93,P<0.05) and that with DMB (q=3.59,P<0.05). Compared with the control group, the MPP+ group showed significantly higher expression of cleaved caspase-3 protein (F=111.60, q=29.44,P<0.001). DMB, BBR, and selegiline significantly reduced MPP+-induced upregulation of cleaved caspase-3 protein (q=10.74-13.53,P<0.001), with no significant difference in the treatment effects of the three drugs (P>0.05).  ConclusionFor SH-SY5Y cells induced by MPP+, DMB can increase the ratio of bcl-2/bax and decrease the expression of cleaved caspase-3 protein.

[KEY WORDS]berberine; SH-SY5Y cells; mitochondria; caspase 3; apoptosis

帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病,常见于老年人,其主要特征为黑质致密部多巴胺能神经元的选择性丧失[1-2]。导致PD的原因有很多,例如神经炎症、氧化应激、单胺氧化酶B(MAO-B)活性异常等。临床治疗PD的方式多为药物治疗[3]。去亚甲基小檗碱(DMB)是小檗碱(BBR)的主要代谢产物之一,被认为是BBR生物发生途径的中心中间体[4]。有研究表明,DMB具有抗氧化、抗炎、抗纤维化以及可逆抑制MAO-B活性的特性,提示DMB可能在神经退行性疾病中具有治疗潜力[5-7]。众所周知,线粒体相关的bcl-2/bax/caspase-3凋亡途径是一条非常典型的caspase依赖性凋亡途径。有研究结果表明,bcl-2、bax蛋白表达水平的变化,会激活caspase-3,启动caspase-3级联反应[8-11]。本研究用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理SH-SY5Y细胞建立体外PD模型,观察DMB以及已经被证明具有保护作用的DMB前体BBR、同样为MAO-B抑制剂的司来吉兰(selegiline)对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞bcl-2/bax比值以及cleaved caspase-3蛋白表达水平的影响。

1材料和方法

1.1实验材料

SH-SY5Y细胞购于中国科学院上海细胞库;DMEM高糖培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素溶液购自以色列Biological Industries公司;MPP+、BBR、selegiline和DMB购自美国GLP-BIO公司;兔抗bcl-2、兔抗bax、兔抗cleaved caspase-3和兔抗GAPDH抗体购自美国Cell Signaling公司;HRP标记山羊抗兔IgG 购自中国Abclonal公司;ECL发光液购于中国雅酶公司。

1.2细胞培养及分组

SH-SY5Y细胞置于温度为37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中,用DMEM高糖培养液培养,该培养液中含有体积分数0.10的胎牛血清和体积分数0.01的青霉素/链霉素。细胞培养2~3 d后进行传代,将状态良好的细胞接种于6孔板中,进行下一步实验。将细胞分为对照组(A组)、MPP+组(B组)、BBR+MPP+组(C组)、selegiline+MPP+组(D组)、DMB+MPP+组(E组)。A组不做任何處理;B组使用1 mmol/L的MPP+处理SH-SY5Y细胞24 h;C组使用0.1 μmol/L的BBR和1 mmol/L的MPP+共同处理SH-SY5Y细胞24 h;D组使用100 μmol/L的selegiline和1 mmol/L的MPP+共处理SH-SY5Y细胞24 h;E组使用1 nmol/L的DMB和1 mmol/L的MPP+共处理SH-SY5Y细胞24 h。

1.3免疫印迹法检测bcl-2、bax、cleaved caspase-3蛋白的表达

各组SH-SY5Y细胞经过药物处理24 h后,用PBS洗涤3次,每孔加入100 μL RIPA裂解缓冲液在冰上裂解30 min。用刮板将细胞刮下,经离心(12 000 r/min,30 min,4 ℃)提取细胞蛋白。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。将含有20 μg蛋白质的样品通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,随后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将膜置于50 g/L的脱脂牛奶中,室温封闭2 h,然后分别加入bcl-2(1∶1 000)、bax(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)和GAPDH(1∶10 000)一抗4 ℃孵育过夜。用TBST洗3次,每次10 min,加山羊抗兔IgG(1∶10 000)二抗室温孵育1 h。用ECL发光液显影,然后使用Image J软件分析bcl-2、bax和cleaved caspase-3蛋白表达。

1.4统计学分析

应用Graphpad Prism 7.0软件进行统计学分析。实验数据以±s表示,多组比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),然后采用Turkey法进行组间两两比较,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1DMB对MPP+处理的SH-SY5Y细胞bcl-2/bax比值的影响

各组细胞bcl-2/bax比值比较差异具有统计学意义(F=42.58,P<0.001)。与对照组相比,MPP+组细胞的bcl-2/bax比值显著降低(q=17.89,P<0.001);与MPP+组相比,DMB+MPP+组、BBR+MPP+组和selegiline+MPP+组的bcl-2/bax比值明显升高,差异有统计学意义(q=6.71~10.63,P<0.001);与BBR+MPP+组和DMB+MPP+组相比较,selegiline+MPP+组bcl-2/bax比值更高(q=3.59、3.93,P<0.05);DMB+MPP+组与BBR+MPP+组相比,bcl-2/bax比值差异无统计学意义。见图1、表1。

2.2DMB对MPP+处理的SH-SY5Y细胞cleaved caspase-3蛋白的影响

各组细胞cleaved caspase-3蛋白水平比较差异具有统计学意义(F=111.60,P<0.001)。与对照组相比,MPP+组的cleaved caspase-3蛋白表达水平显著上调(q=29.44,P<0.001);与MPP+组相比,DMB+MPP+组、BBR+MPP+组、selegiline+MPP+组的cleaved caspase-3蛋白表达降低,差异具有统计学意义(q=10.74~13.53,P<0.001);3种药物处理组之间相比,cleaved caspase-3蛋白表达水平差异无显著性。见图1、表1。

3討论

PD是一种常见于老年人的神经退行性疾病[12],其主要病理特征为黑质致密部多巴胺能神经元的选择性丧失、路易小体(主要成分为α-突触核蛋白)形成[13]。PD的临床表现主要包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍,同时病人可伴有抑郁、便秘和睡眠障碍等非运动症状[14]。临床治疗方式主要为药物治疗,包括多巴胺类似物、多巴胺受体激动剂、神经保护剂等。手术治疗是药物治疗的一种有效补充;康复治疗、心理治疗及良好的护理也能在一定程度上改善症状[15-16]。有效的治疗能显著提高PD病人的生活质量,PD病人的预期寿命与普通人群并无显著差异[17]。

DMB存在于天然药用植物芸香科植物黄柏中,亦可由盐酸小檗碱经过肝脏的首过效应代谢生成。DMB是BBR的主要代谢产物之一,是BBR生物合成的关键中间体,并且DMB在通过血-脑脊液屏障和发挥治疗作用方面比BBR更加有效。DMB具有抗氧化、抗炎、抗纤维化的特性。许多研究表明,DMB能抑制丝裂原活化蛋白激酶信号[18],参与抑制核因子κB,因此认为DMB可以作为一种神经保护药物用于治疗PD[19]。而且,由于DMB可促进AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)信号传导,推测它可能通过调节AMPK的信号传导而有助于PD的神经保护[20]。有大量证据表明,多巴胺是MAO-B的底物,MAO-B抑制剂可以通过增加多巴胺含量治疗PD[21]。而有研究表明,DMB可以可逆地抑制MAO-B活性[22]。良好的生物活性使得DMB成为一个有吸引力的合成靶点,DMB可能在神经退行性疾病中具有治疗潜力[23]。

已知MPP+是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的有毒代谢产物[24],其结构接近多巴胺,会通过中脑多巴胺转运蛋白被选择性地转运进入神经元,选择性地毒害多巴胺能神经元,从而导致PD的症状[25]。本研究应用MPP+制备体外PD模型,探究DMB对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体caspase依赖性凋亡通路的影响。本实验结果显示,经MPP+处理的SH-SY5Y细胞bcl-2/bax比值降低,cleaved caspase-3蛋白表达明显增加。这表明细胞在受到损伤后bcl-2/bax比值会降低,并且伴随着cleaved caspase-3蛋白含量的增加。有研究表明,BBR对MPTP诱导的PD模型小鼠多巴胺能神经元损伤具有保护作用[26]。另有研究表明,selegiline作为一种MAO-B抑制剂,对神经元的损伤具有保护作用[27-28]。为了检测DMB是否具有细胞保护作用,本研究使用DMB的前体BBR以及同为MAO-B抑制剂的selegiline与DMB进行对照,而这两种药物均已被证实具有细胞保护作用。有研究表明,bcl-2具有抗凋亡作用[29]。bax接收到凋亡信号刺激被激活后会破坏线粒体膜的完整性,释放cyt-c,进一步将caspase-3剪切为具有凋亡活性的cleaved caspase-3[30]。本实验结果显示,DMB处理能够有效抑制MPP+诱导引起的bcl-2/bax比值的降低,而且,MPP+诱导引起的cleaved caspase-3表达的升高在经DMB处理之后也会被抑制。BBR、selegiline、DMB虽然都有明显的抑制MPP+诱导引起的bcl-2/bax比值降低的作用,但selegiline的效果要略强于BBR和DMB,而DMB与BBR之间并无明显差别。BBR、selegiline、DMB均具有明显的抑制MPP+诱导引起的cleaved caspase-3表达升高的作用,且3种药物作用效果无明显差异。推测这种现象产生的原因可能为:DMB与BBR同为小檗属植物的天然产物,在特性上具有一定的相同之处,而selegiline并非天然植物产物,在作用方式上可能会与小檗属植物天然产物有所不同,从而在作用效果上产生差异。但其具体机制仍需进一步研究。

综上所述,本实验初步证明,DMB能够通过升高bcl-2/bax比值、降低cleaved caspase-3蛋白表达,抑制线粒体caspase依赖性的凋亡途径,从而对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞起到保护作用。本研究为DMB作为神经保护药物治疗PD提供了新的方案,但DMB起保护作用的深层机制还有待继续研究。

[参考文献]

[1]CONNOLLY B S, LANG A E. Pharmacological treatment of Parkinson disease: a review[J]. JAMA, 2014,311(16):1670-1683.

[2]CACABELOS R. Parkinsons disease: from pathogenesis to pharmacogenomics[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2017,18(3):551.

[3]BUCHANAN B, MENG Q F, POULIN M M, et al. Compa-rative pharmacokinetics and safety assessment of transdermal berberine and dihydroberberine[J]. PLoS One, 2018,13(3):e0194979.

[4]WANG K, FENG X C, CHAI L W, et al. The metabolism of berberine and its contribution to the pharmacological effects[J]. Drug Metabolism Reviews, 2017,49(2):139-157.

[5]GUPTA S, KHAN A, VISHWAS S, et al. Demethyleneberberine: a possible treatment for Huntingtons disease[J]. Medical Hypotheses, 2021,153:110639.

[6]KONG L D, CHENG C H, TAN R X. Monoamine oxidase inhibitors from rhizoma of Coptis chinensis[J]. Planta Medica, 2001,67(1):74-76.

[7]SAKLANI P, KHAN H, SINGH T G, et al. Demethyleneberberine, a potential therapeutic agent in neurodegenerative disorders: a proposed mechanistic insight[J]. Molecular Biology Reports, 2022,49(10):10101-10113.

[8]LI X Y, WANG J, GONG X, et al. Upregulation of BCL-2 by acridone derivative through gene promoter i-motif for alleviating liver damage of NAFLD/NASH[J]. Nucleic Acids Research, 2020,48(15):8255-8268.

[9]KIRKLAND R A, FRANKLIN J L. Bax, reactive oxygen, and cytochrome c release in neuronal apoptosis[J]. Antioxi-dants & Redox Signaling, 2003,5(5):589-596.

[10]PEA-BLANCO A, GARCA-SEZ A J. Bax, bak and beyond—mitochondrial performance in apoptosis[J]. The FEBS Journal, 2018,285(3):416-431.

[11]CHOUDHARY G S, AL-HARBI S, ALMASAN A. Caspase-3 activation is a critical determinant of genotoxic stress-induced apoptosis[J]. Methods in Molecular Biology, 2015,1219:1-9.

[12]LEES A, HARDY J, REVESZ T. Parkinsons disease[J]. The Lancet, 2009,373(9680):2055-2066.

[13]WAKABAYASHI K, TANJI K, ODAGIRI S, et al. The lewy body in Parkinsons disease and related neurodegenerative disorders[J]. Molecular Neurobiology, 2013,47(2):495-508.

[14]JANKOVIC J. Parkinsons disease: clinical features and diagnosis[J]. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 2008,79(4):368-376.

[15]CABREIRA V, MASSANO J. Parkinsons disease: clinical review and update[J]. Acta Medica Portuguesa, 2019,32(10):661-670.

[16]GITLER A D, DHILLON P, SHORTER J. Neurodegenerative disease: models, mechanisms, and a new hope[J]. Di-sease Models & Mechanisms, 2017,10(5):499-502.

[17]GOLBE L I, LEYTON C E. Life expectancy in Parkinson di-sease[J]. Neurology, 2018,91(22):991-992.

[18]ZHANG M, LI Q X, ZHOU C S, et al. Demethyleneberbe-rine attenuates concanavalin A-induced autoimmune hepatitis in mice through inhibition of NF-κB and MAPK signaling[J]. International Immunopharmacology, 2020,80:106137.

[19]WANG Y C, ZHAO Z, YAN Y, et al. Demethyleneberberine protects against hepatic fibrosis in mice by modulating NF-κB signaling[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2016,17(7):1036.

[20]QIANG X Y, XU L L, ZHANG M, et al. Demethyleneberberine attenuates non-alcoholic fatty liver disease with activation of AMPK and inhibition of oxidative stress[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016,472(4):603-609.

[21]CARRADORI S, D'ASCENZIO M, CHIMENTI P, et al. Selective MAO-B inhibitors: a lesson from natural products[J]. Molecular Diversity, 2014,18(1):219-243.

[22]TAO C, HU S Q, CHEN J, et al. Highly efficient synthesis and monoamine oxidase B inhibitory profile of demethyleneberberine, columbamine and palmatine[J]. Neurochemistry International, 2020,139:104807.

[23]WANG Z H, WANG L X, SHI B Y, et al. Demethyleneberberine promotes apoptosis and suppresses TGF-β/Smads induced EMT in the colon cancer cells HCT-116[J]. Cell Biochemistry and Function, 2021,39(6):763-770.

[24]NICKLAS W J, YOUNGSTER S K, KINDT M V, et al. MPTP, MPP+ and mitochondrial function[J]. Life Sciences, 1987,40(8):721-729.

[25]EBERLING J L, BANKIEWICZ K S, PIVIROTTO P, et al. Dopamine transporter loss and clinical changes in MPTP-lesioned Primates[J]. Brain Research, 1999,832(1-2):184-187.

[26]DENG H, MA Z G. Protective effects of berberine against MPTP-induced dopaminergic neuron injury through promoting autophagy in mice[J]. Food & Function, 2021,12(18):8366-8375.

[27]SZ?K? ?, TBI T, RIEDERER P, et al. Pharmacological aspects of the neuroprotective effects of irreversible MAO-B inhibitors, selegiline and rasagiline, in Parkinsons disease[J]. Journal of Neural Transmission, 2018,125(11):1735-1749.

[28]MAGYAR K. The pharmacology of selegiline[J]. Internatio-nal Review of Neurobiology, 2011,100:65-84.

[29]BRUCKHEIMER E M, CHO S H, SARKISS M, et al. The Bcl-2 gene family and apoptosis[J]. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 1998,62:75-105.

[30]董雅洁,高维娟. bcl-2、bax、caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系[J]. 中国老年学杂志, 2012,32(21):4828-4830.

(本文編辑马伟平)

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