基于网络药理学探讨黄芪治疗慢传输型便秘的作用机制

施 敏 刘富林 夏旭婷 张 婷

(湖南中医药大学,长沙,410208)

慢传输型便秘(Slow Transit Constipation,STC)是指因为结肠传输功能障碍而导致的肠内容物滞留或排出不顺利的状态[1]。Preston和Lennard-Jones[2]在1986年首次提出STC的概念,认为临床主要以便意减退或消失、便次减少,粪质干结、排便不畅并伴随腹部不适等症状为主要表现。流行病学研究显示,STC在慢性便秘中发病率占首位[3],其发病机制尚不明确,现有研究认为可能与肠神经递质、Cajal间质细胞、肠道菌群等多种因素有关[4-6]。STC不仅严重影响患者的生命质量,且易导致肛肠、心脑血管等危险疾病发生。目前西医主要有药物和手术治疗[7],而西药有一定的依赖性和不良反应,手术治疗存在风险性,STC在中医学归属于便秘范畴,传统中医治疗STC有其独特的优势作用[8]。STC多以虚证为主,少有实证。《丹溪心法·脾约丸论》云:“胃强脾弱,约束津液不得四布……故曰脾约……脾弱不得通也。”故STC治疗重点在于健脾益气。黄芪有健脾益气的功效,现代药理学研究证明,黄芪有调节机体免疫功能的作用,尤其适用于体虚的老年便秘患者[9]。单崇武[10]用黄芪汤加味治疗将50例肺脾气虚型功能性便秘患者,观察组总有效率为88.0%,高于对照组50例的70.0%。

本研究基于系统生物学相关理论[11],借助网络药理学方法和分子对接技术,探讨黄芪的活性化合物与靶点之间的关系,探究黄芪多成分、多靶点、多通路治疗STC的作用机制,以期为黄芪治疗STC提供科学依据与临床应用参考。

1 资料与方法

1.1 黄芪活性成分和靶蛋白 应用中药系统药理分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索并结合文献[12-17]筛选黄芪的活性成分,以类药性(Drug Likeness,DL)≥0.18和口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%进行筛选,得到黄芪的有效成分,并下载其分子结构,同时检索活性成分对应的靶蛋白。筛选完成后统一在Uniprot(https://www.uniprot.org/)蛋白质数据库、美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库输入靶点蛋白名称,限定物种为“Homo sapiens”将化合物作用的蛋白质靶点进行规范。

1.2 STC疾病靶点筛选 在人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM,http://omim.org/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中输入关键词“slow transit contipation”检索疾病靶点。去除重复靶点并经Uniprot校正整合得到STC相关靶点。运用R语言(VennDiagram包)将黄芪有效成分的靶蛋白与STC疾病靶点取交集,得到黄芪治疗STC的靶点。

1.3 构建黄芪中药-活性成分-疾病靶基因网络图 借助Cytoscape 3.7.2软件构建中药-活性成分-疾病基因网络,并计算其相关网络特征值。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI) 将黄芪与STC交集靶基因导入String(https://string-db.org/)数据库,将物种设定为“Homo sapiens”,相互作用阈值设定为“median confidence”(0.4),其余均为默认设置,获取交互作用,构建PPI网络并计算其网络中每个靶基因Degree,采用R语言绘制Degree最大的前20个靶基因的柱状图。将得到的PPI网络导入CytoScape3.7.2,借助CytoNCA插件分析靶点的连接度(Degree)、介度(Betweenness)等网络拓扑参数,根据Degree和Betweenness≥2倍中位数筛选核心靶点。将疾病与中药取交集得到的基因进行PPI分析,得到PPI网络图其中“边”代表作用靶基因之间的关联,粗细用combine score表示,“边”越粗,combine score值越大,代表其结合度越大;节点代表作用靶基因。

1.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 应用R语言(dose、clusterProfiler、enrichplot包)从生物过程(Biological Process,BP),细胞组分(Cellular Component,CC),分子功能(Molecular Function,MF)进行GO通路富集分析,同时进行KEGG通路富集分析,设定阈值P<0.05,绘制条形图和气泡图以进一步揭示黄芪治疗STC的作用机制。

1.6 分子对接 在蛋白质结构数据库(http://www.rcsb.org/)下载核心靶蛋白的3D结构pdb格式文件,用Pymol软件移去水分子和配体分子,在TCMSP中下载化合物3D结构的mol格式。导入Swiss Dock在线分子对接工具(http://www.swissdock.ch/)将靶点与黄芪活性成分进行对接,用以评价活性成分与关键靶点之间的对接效果。

2 结果

2.1 筛选黄芪的活性成分和靶蛋白 筛选到黄芪所含20个活性成分。见表1。筛选出作用靶基因953个,去重后获得相关靶基因189个。

表1 黄芪主要活性成分

2.2 STC疾病靶基因 筛选从GeneCards和OMIM数据库检索分别得到STC靶基因3 278个、143个,整合后共3 817个,经过Uniprot校正整合后得到3 174个,将其与2.1得到的药物作用靶基因189个借助R语言取交集得到PGR、NOS2、PTGS1、AR、SCN5A等共143个。见图1。

图1 药物-疾病交集基因韦恩图

2.3 构建黄芪中药活性成分-疾病靶基因网络图 得到黄芪-活性成分-疾病靶基因网络见图2。各节点上连线越多,代表其相关的靶基因和成分越多。

图2 黄芪活性成分-疾病网络

2.4 PPI网络的构建及拓扑分析 共有143个节点、2 353条边,平均节点度为32.9,平均局部聚类系数为0.619。见图3。

图3 靶基因PPI网络

Degree最大的前20个靶基因。Degree值排名前10位的核心节点分别为AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN、MYC、MAPK8、EGF、EGFR、MAPK1。见图4。

图4 靶基因Degree值柱状图

Degree值排在前10位的分别为JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6、MAPK1、EGF、MAPK8、MYC、EGFR。黄芪治疗STC的核心调控网络见图5。

图5 靶基因调控网络拓扑分析

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析 GO功能富集分析得到GO条目2 173个,其中生物过程、细胞组分、分子功能各1 943个、77个、153个。生物过程主要与对脂多糖的回应、对细菌起源分子的反应、对抗生素的反应等信号通路有关;在细胞组分主要与薄膜筏、膜微区、膜区、突触后膜的组成部分等信号通路有关;在分子功能主要与核受体结合、类固醇激素受体活性、泛素样蛋白连接酶结合、组蛋白激酶活性、泛素-蛋白连接酶结合等信号通路有关。见表2。

表2 GO功能富集分析结果

KEGG富集分析共得到163条信号通路,可知黄芪可通过乙型肝炎、前列腺癌、IL-17信号通路、TNF信号通路等作用通路发挥对STC的治疗作用,KEGG通路富集分析结果前20个条形图和气泡图,条形图颜色代表富集程度,条形长度代表富集的基因数目,气泡图颜色代表富集程度,气泡大小代表富集的基因数目。见图6。

图6 KEGG通路富集分析条形图和气泡图

2.6 分子对接 分子对接结果显示叶酸、1,7-二羟基-3,9-二甲氧基紫檀素、山柰酚、槲皮素4种成分与5个靶点结合比较紧密。见表3。蛋白质与小分子结合越紧密,结合能值越低,可看出叶酸和IL-6形成氢键作用,使得蛋白与化合物形成稳定的复合物。见图7。

图7 叶酸与IL-6对接图

表3 分子对接结果

3 讨论

慢传输型便秘是由于大肠传导功能紊乱而导致的排便困难,中医学归属不大便、脾约等范畴[18]。其病机主要为气虚大肠传导无力。本病属本虚标实,主要以脾气虚为主。《症因脉治》中指出气虚则大肠传道失司,肠失濡润致糟粕传送失常,形成腑气不通,而致便秘[19]。黄芪有补气健脾、升阳举陷、利水消肿的功效,临床上用于治疗肺脾气虚证等。有研究表明,黄芪可明显升高脾虚小鼠Hb值、LAK细胞活性、白细胞介素-2活性及CD4+/CD8+细胞比值,并对其免疫功能低下有改善作用[20]。余克强等[21]通过对26项研究1 955例患者进行Meta分析证明以黄芪为主的中成药或方剂治疗气虚型功能性便秘安全有效。

本研究从化合物-靶点网络图可知,黄芪中山柰酚、叶酸、槲皮素、异鼠李素、芒柄花素等20个化合物作用于STC疾病相关的143个靶点,说明了黄芪是通过多成分、多靶点协同发挥治疗STC的作用。String在线数据库所得PPI网络显示节点度排名前的核心节点有AKT1、IL-6、VEGFA、CASP3、JUN。核心基因调控网络图拓扑分析结果中Degree值靠前的有JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6。二者取交集得到黄芪治疗STC的关键核心靶点AKT1、JUN、IL-6、VEGFA、CASP3。

AKT1是PI3K/AKT信号通路下游的主要靶点,主要参与调节炎症反应[22]。张高松[23]通过实验研究推导出AKT在STC大鼠表达的减少可能是STC发病机制之一。现有研究认为JUN主要与癌症的发生有关,JUN癌基因激活后其蛋白以JUN或JUN同源二聚体的形式结合到转录激活蛋白1启动子结合位点,诱导癌基因表达,参与细胞恶性转化[24-25]。IL-6具有广泛的促炎症反应作用,其过度表达会造成肠道炎性病变[26],并可导致胃肠运动及分泌功能紊乱,其作用机制可能与激活胃肠道黏膜下层的神经元影响肾上腺应激反应和胃肠蠕动有关[27]。血管内皮生长因子A基因的表达可使肠道细胞间的紧密连接松弛,损伤肠黏膜屏障从而导致肠道微生物入侵肠壁[28]。李超[29]报道胱天蛋白酶3是细胞凋亡途径中的关键角色,肠细胞的非正常凋亡可能会引起肠黏膜屏障破坏受损,进一步造成STC的发生。GO富集分析预测出黄芪对STC的治疗机制可能是通过对脂多糖的回应、对细菌起源的分子反应、薄膜筏、膜微区、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、核受体结合、类固醇激素受体活性产生作用的。

KEGG富集分析预测出黄芪对STC的治疗机制可能是通过流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、IL-17信号通路产生作用的,结合黄芪主要活性成分和其作用靶点,我们推测黄芪可能通过抗炎、提高免疫、保护肠黏膜屏障、调节肠道菌群和神经递质等作用机制,从而促进肠道运动,达到益气健脾、通阳利水的功效,改善STC症状。

本研究得到的相关通路虽然与目前研究较多的胶质细胞源性神经营养因子/生长因子受体α1/神经细胞黏附分子、SCF/c-kit、5-羟色胺、cAMP依赖性蛋白激酶和促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酶C-γ1/PLC-γ2等典型的治疗STC信号通路不大相同[30-34],说明了黄芪治疗STC是以多靶点、多通路的形式来发挥作用的,也恰恰体现了黄芪多功效治疗STC的特点。

黄芪有效成分与STC疾病靶点分子对接结果显示山柰酚、叶酸、槲皮素与JUN、VEGFA、AKT1、CASP3、IL-6核心靶点结合较好。相关研究显示槲皮素可抑制肠炎小鼠血清中髓过氧化物酶、丙二醛和一氧化氮水平升高,减轻细胞氧化损伤,从而改善肠道微生物群失调[35]。汤利华等[36]研究发现,山柰酚可通过抑制DN大鼠NLRP3炎性小体的激活,从而抑制炎症介质的表达。叶酸可增强机体免疫能力,因此可用于免疫功能低的便秘患者治疗,但目前尚无公开发表的叶酸与STC相关的研究文献。

黄芪可能通过抗炎、提高免疫力、保护肠黏膜屏障、调节肠道菌群和神经递质,从而促进肠道运动等过程改善STC症状;通过调控对脂多糖的回应、对细菌起源的分子的反应、薄膜筏、膜微区、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物、核受体结合、类固醇激素受体活性、乙型肝炎、IL-17信号通路等信号通路发挥治疗STC作用。

本研究借助网络药理学方法与分子对接技术,探讨了黄芪活性成分、靶点、通路之间相互作用的关系,发现黄芪能通过多靶点、多通路发挥治疗STC的作用,证明了黄芪是通过多途径发挥行气健脾,通阳利水的功效,达到治疗STC的目的,为黄芪用于治疗STC的进一步实验验证及临床研究提供了思路与理论基础。

利益冲突声明:无。