不同来源接种物对不同原料产氢烷潜力的影响及微生物群落结构分析

李 凯, 赵紊骁赟, 刘思雨, 张欣蕾, 李禄恩, 梅宝帆, 井琳琳, 孙雅雅, 袁海荣

(北京化工大学 化工资源有效利用国家重点实验室, 环境科学与工程系, 北京 100029)

厌氧消化是一种很好的处理有机废物并产生氢烷的能源化转化技术。厌氧消化系统的启动都离不开良好的接种物,接种物的优劣是影响厌氧消化启动成败的关键。影响厌氧消化的因素有很多[1],研究者的关注点主要集中在温度[2]、pH值[3]、有机负荷[4]等因素对厌氧消化性能的影响上,对单纯接种物的研究相对较少。

接种物是影响厌氧消化的主要参数之一。Hossain[4]等研究了温度、接种物类型和接种比对干式厌氧消化沼气产量的影响,发现厌氧污泥和牛粪混合比为1∶2的混合物作为接种物时,城市有机固体废物的甲烷产量最高,但没有对接种物中的微生物进行分析。Li[5]等对比了北郎中养猪厂的中温厌氧消化沼液、北京城市污水处理厂的废活性污泥和顺义酿酒厂的活性颗粒污泥3种接种物对牛粪、玉米秸秆和蕃茄秧共消化的影响,发现猪粪沼液作为接种物时混合物的产甲烷量最高,活性颗粒污泥作为接种物时混合物的挥发性脂肪酸浓度较高,并对3种接种物进行了简单的微生物群落结构分析,但未对比3种不同接种物之间的差异性。Aarle[6]等研究了厌氧污泥、颗粒污泥和产酸发酵液3种接种物分别对3种复杂的木质纤维素原料酸化产挥发性脂肪酸的影响。刘伟[7]等对比了5种接种物对牛粪高温厌氧消化产气性能的影响,发现接种物为沼液底物和二沉污泥的混合物时牛粪厌氧产气效果最好。

综上所述,研究者们以不同原料为基质,采用了多种不同接种物进行厌氧消化实验,主要研究了不同接种物对不同基质的产气性能方面的影响,很少有人关注不同接种物之间微生物群落结构变化和不同接种物之间微生物的差异性。由于在厌氧消化过程中,真正对厌氧消化起作用的是接种物里面的微生物,因此,探明不同接种物的群落结构特性及其差异性,关系到能否正常启动厌氧消化系统,是厌氧消化系统启动成败的关键所在。所以,研究不同接种物对不同原料的产气潜力及其微生物群落结构及差异性非常有必要。

1 材料与方法

1.1 实验原料

为了评价不同来源的接种物是否适合作为厌氧消化的接种物,3种发酵原料被采用,分别为玉米秸秆、青稞秆和厨余垃圾,分别取自北京市延庆区、西藏拉萨市和北京化工大学学生食堂。秸秆经风干粉碎至20目后备用,厨余垃圾除杂后用垃圾粉碎机粉碎后备用。实验选取3种接种物,分别为牛粪、秸秆厌氧消化液和餐厨干发酵出料,为表述方便,分别命名为NF、ZY、CN,3种接种物分别取自北京大兴区金银岛牧场、三河市盈盈生物有限公司和北京化工大学固废实验室。原料和接种物的基本性质如表1所示。

表1 原料及接种物基本性质*

1.2 实验方法

产氢烷潜力实验采用批式厌氧消化方式。实验装置由500 mL蓝盖瓶(有效体积为400 mL)、集气瓶、乳胶管、三通等组成(见图1)。将ZY、NF和CN分别作为消化青稞秆、玉米秸秆和厨余垃圾的接种物,并考察其产氢和产甲烷潜力。将3种实验原料分别与不同接种物按干物质比1∶2混合放入蓝盖瓶,加入去离子水至有效体积,充分搅拌均匀后封盖,然后置于恒温水浴箱中,保持反应器内温度为35 ℃±1 ℃,每天定时手动摇动发酵瓶两次,采用排水集气法收集所产生的气体,每天记录气体产量并用气相色谱仪测定气体中氢气、甲烷和二氧化碳等气体成分,计算氢气出和甲烷的产量。每个反应瓶加入20 gTS原料,为了考察不同接种物是否能快速且正常启动厌氧消化反应系统并顺利进入甲烷化阶段,厌氧消化时间设定为10天。同时设置纯ZY、NF和CN接种物作为空白对照,实验结果均扣除接种物空白产气量,每组实验设置3个平行样,实验结果为3平行样的平均值。

图1 实验装置示意图

1.3 分析方法

样品的总固体含量(TS)和挥发性固体含量(VS)采用国标法进行测定。碱度采用溴甲酚绿-甲基红指示剂滴定;氨氮含量采用HI83206高精度试验室多参数测定仪进行测定;pH值、总挥发性脂肪酸(TVFA)和气体含量分别采用pH 计、气相色谱仪(岛津GC—2014)和气相色谱仪(SP—2100)进行测定。选取NF、ZY和CN这3种接种物样品送至上海美吉生物公司进行微生物测定,细菌和古菌PCR的引物分别为338F (5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)和524F10ext(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)、Arch958Rmod (5’-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3’)。基于16S rDNA高通量测序技术对样品中的微生物群落进行分析。并根据Illumina MiSeq 平台上的标准操作规程进行测序,相关微生物图通过上海美吉生物云平台进行在线作图。

2 结果与讨论

2.1 产氢烷潜力分析

产氢烷速率和产氢烷潜力是评价接种物优劣的两个重要指标,不同接种物中加入青稞秆、玉米秸秆和厨余垃圾后其产氢烷速率和产氢烷潜力如图2～图4所示。由图2可以看出:在厌氧发酵的第1天,厨余-CN组产甲烷速率最高,达到42.4 mL·g-1VS·d-1,然后产甲烷速率迅速下降,从第4天开始产气几乎为0。青稞秆-ZY和玉米秸秆-NF组产甲烷速率逐渐缓慢上升,到第10天时,日甲烷产量分别达到11.4和14.4 mL·g-1VS·d-1。厨余-ZY组在10天的发酵周期内几乎未产甲烷。在厌氧发酵的前2天,玉米秸秆-NF和厨余-ZY组表现出良好的产氢气优势,最大日产氢气速率分别为26.5和15.8 mL·g-1VS·d-1,最大氢气含量分别为39.5%和21.0%(见图3)。从气体含量来看(见图3),不同实验组中(厨余-ZY组除外)甲烷含量均呈快速上升趋势,从第3～4天开始,甲烷含量均已超过30%,到第10天时,不同实验组的甲烷含量为56.7%～70.9%,玉米秸-NF组从第4天开始甲烷含量达到61.4%～71.6%。由图4可知,玉米秸秆-NF组在10天的厌氧消化周期内累积甲烷产量最高,为80.9 mL·g-1VS,分别高出青稞秆-ZY、青稞秆-CN和厨余-CN组54.5%、255.4%和18.1%,这说明NF接种物更适合消化秸秆。同时玉米秸秆-NF组和厨余-ZY组的累积氢气产量分别为33.9和27.1 mL·g-1VS。因此,玉米秸秆-NF组在产甲烷和产氢气方面均为最优,其次是厨余-CN组。这说明接种物消化同源原料更容易,也就是NF接种物更适合消化秸秆,而CN接种物更适合消化厨余垃圾,这个现象与之前用不同来源沼液作为预处理剂后厌氧产甲烷的结果相似[3]。

图2 不同接种物条件下日产气甲烷和氢气速率

图3 不同接种物条件下甲烷和氢气含量的变化

图4 不同接种物条件下累积甲烷产量和氢气产量

2.2 微生物群落结构分析

2.2.1 细菌和古菌群落结构

细菌在门水平和属水平上的相对丰度如图5～图7。不同接种物中的细菌在12个门和57个属上相对丰度较高。其中厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)在3种接种物中相对丰度占绝对优势,分别为35.3%～53.2%和11.6%～36.5%(见图5)。Firmicutes和Bacteroidota是厌氧发酵中最常见的两个门,其中Firmicutes的主要作用是产生纤维素酶、蛋白酶和各种胞外酶来降解各种复杂有机物,其中部分Firmicutes具有降解纤维素的能力;Bacteroidetes的主要作用是将大分子有机物降解成小分子的酸类物质[8]。在NF接种物中,Firmicutes和Bacteroidota的相丰度均为最高,这说明NF接种物的水解酸化能力最强,可以很快将原料降解成小分子物质,这与玉米秸秆-NF组产甲烷和产氢气的能力均为最强相对应。在属水平上(见图7),CN接种物中优势菌种为未分类的多伊卡菌门g_norank_f_norank_o_norank_c_Dojkabacteria(19.20%),属于Bacteroidota门类,该类细菌主要与碳水化合物降解有关,能够适应极端环境[9]。这就是pH值为4.2的厨余垃圾(见表 1)在CN接种物条件下也能很好地厌氧消化产甲烷而厨余-ZY组则产气不佳的主要原因,因为ZY接种物中缺少大量适应极端环境的细菌。在ZY接种物中,相对丰度最高的是Candidatus_Caldatribacterium(10.2%)。NF接种物中,优势菌种为紫单胞菌(Proteiniphilum)、热杆菌(Turicibacter)、发酵单胞菌(Fermentimonas)和赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus),相对丰度分别为16.2% 、12.6%、10.4%和9.0%。Fermentimonas和Proteiniphilum能够利用不同类型的碳水化合物和纤维素产生氢气、VFA和CO2以及利用含N类物质作为能源产生乙酸[10],Turicibacter主要参与糖类发酵物质的代谢,其代谢产物主要为乳酸[11]。因此,NF接种物以玉米秸为原料时,能够既产生甲烷,也能够产生氢气。总体来说,上述细菌大都属于Firmicutes、Bacteroidota和Proteobacteria菌门,对促进厌氧消化底物的水解起重要作用。

图5 细菌在门水平上的相对丰度

图6 古菌在门水平上的相对丰度

图7 细菌在属水平上的相对丰度

在甲烷化阶段,不同的古菌对产甲烷起到重要的作用,在门水平和属水平的相对丰度如图6、图8。广古菌门(Euryarchaeota)和卤杆菌门(Halobacterota)在门水平上的相对丰度占据绝对优势,两者的相对丰度之和占门水平总相对丰度的96.95%～99.95%(见图6)。其中ZY接种物中Euryarchaeota和Halobacterota的相对丰度分别为52.9%和44.0%。NF和CN接种物中相对优势菌门为Halobacterota(80.9%)和Euryarchaeota(98.6%)。在属水平上,3种接种物之间有明显区别(图8)。Methanosphaera是CN接种物中的优势菌种,相对丰度占98.2%。在NF接种物中,优势菌种为Methanocorpusculum和Methanobrevibacter,其相对丰度分别为80.5%和18.6%。ZY接种物中的甲烷菌多样性比NF和CN接种物中的优势甲烷菌种类丰富得多,相对丰度大于1%的甲烷菌有8种,其中优势菌种为甲烷鬃毛菌(Methanosaeta)、甲烷杆菌(Methanobacterium)和甲烷短杆菌(Methanobrevibacter),其相对丰度分别为41.7%、31.2%和16.4%。Methanosaeta的主要作用是能够利用不同种类的底物,它可以将甲基胺或甲醇转化为甲烷和二氧化碳,或者将氢气、二氧化碳和乙酸转化成甲烷[12]。Methanosphaera、Methanocorpusculum和Methanobrevibacter属于氢营养型产甲烷菌,氢营养型产甲烷古菌利用氢气、甲酸盐等电子供体还原二氧化碳产生甲烷[8]。由于厨余垃圾易酸化,在CN接种物中其水解酸化过程产生的氢气很容易被氢营养型产甲烷菌Methanosphaera所利用,因此,CN接种物中加入厨余垃圾更适合产甲烷。而在厨余-ZY组,由于ZY接种物中缺少Methanosphaera(1.9%),而能利用氢气产甲烷的Methanobrevibacter丰度仅为16.4%,远低于在CN接种物中98.2%丰度的Methanosphaera,故厨余-ZY组的产氢量高,而产甲烷量最低。由于NF接种物中含有极其丰富的氢营养型产甲烷菌和产氢产酸细菌,因此,NF接种物组产氢和产甲烷效果均最佳。

图8 古菌在属水平上的相对丰度

2.2.2 微生物差异性分析

为了进一步分析不同接种物之间微生物的不同,对不同接种物进行了属水平上的组间差异性分析(见图9、图10)。由图可知,不同接种物之间在细菌和古菌上的差异性非常明显。NF接种物与CN和ZY接种物相比,NF接种物中的Proteiniphilum、Turicibacter、Fermentimonas和Lysinibacillus的相对丰度与接种物CN和ZY中相应地细菌在相对丰度上存在显著性差异((9.0%～15.3%)***,p≤0.001)和((8.8%～15.6%)***,p≤0.001),Dojkabacteria和norank_f__W27在NF和CN接种物中也存在明显差异(-11.0%～-19.2%)***,p≤0.001 )(见图9)。在古菌属水平上,NF接种物中的古菌Methanosphera、Methanocorpusculum和Methanobrevibacter的相对丰度与CN接种物中相应古菌的相对丰度存在显著性差异(-97.8%***, 18.5%～80.5%***,p≤0.001),NF与ZY接种物中的Methanocorpusculum、Methanosaeta和Methanobacterium的相对丰度也存在显著性差异(80.5%***,-41.7%***和-31.1%***,p≤0.001)(见图10)。这说明不同接种物之间在属水上的细菌和古菌均存在较大显著性差异。这可以很好地解释出不同接种物在产氢烷方面的能力是不同的。

图9 细菌在属水平上的差异

图10 古菌在属水平上的差异

2.2.3 微生物群落与接种物特性的相关性分析

接种物中的pH值、氮氨、碱度和TVFA等基本特性会直接影响接种物中微生物群落结构,最终影响接种物环境下的原料产氢气和产甲烷的能力。因此,明确接种物基本特性与接种物中微生物群落结构的相关性,有助于分析原料的产气潜力。不同接种物特性与微生物群落结构的相关性如图11～图14所示。由图11可知:接种物中的pH值和TVFA分别与Fastidiosipila、norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27和Sedimentibacter、Romboutsia、Paeniclostridium呈现出显著的正相关性(R=1.0***),与Turicibacter、Lysinibacillus和Gallicola、Pseudomonas、Rikenellaceae_RC9_gut_group表现出显著的负相关性(R=-1.0***)。碱度和氨氮分别与Turicibacter、Lysinibacillus和Proteiniphilum、Fermentimonas、Acholeplasma表现出显著性正相关性,而与norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27、Fastidiosipila和Candidatus_Caldatribacterium、norank_f__norank_o__MBA03、Christensenellaceae_R-7_group、_Caldicoprobacter、 norank_f__norank_o__norank_c__JS1表现出强烈地负相关。产氢潜力与接种物中碱度和微生物的相关性相似,而产甲烷潜力与接种物中氨氮与微生物的相关性一致。同时分析图12可知,接种物中的碱度和产氢能力与Methanobrevibacter正相关(R=1***),pH值与Methanobrevibacter显示出极强的负相关性(R=-1***)。Methanosphaera与pH值呈现出正相关性,与碱度和氢气产量呈现出负相关性。Methanocorpusculum与氨氮和甲烷产量呈现出极强的正相关性(R=1***)。这表明norank_f__norank_o__norank_c__Dojkabacteria、norank_f__W27、Fastidiosipila的丰度与产氢能力呈现正相关,Methanocorpusculum的相对丰度与产甲烷能力呈现正相关。综合图11、12可说明,接种物中的细菌和古菌微生物与原料的产氢和产甲烷潜力有关系。由细菌和古菌在属水平上的网络关系图13、14可以进一步直观地看出微生物与接种物的基本特性之间的关系。厌氧消化系统中TVFA影响厌氧消化过程中Gallicola等19种细菌和Methanothermobacter等2种古菌的丰度,产氢潜力与Turicibacter等10种细菌和Methanosphaera等2种古菌丰度的有关。产甲烷潜力受Proteiniphilum等17种细菌和Methanocorpusculu等9种古菌的影响。这说明接种物中有多种的细菌和古菌共同分工协作,对加入到接种物系统中的原料的产氢和产甲烷潜力共同起作用。

图11 细菌与接种物特性相关性热图

图12 古菌与接种物特性相关性热图

图14 古菌网络

3 结论

不同接种物中加入不同原料后其产氢烷速率和产氢烷潜力有明显不同,接种物消化同源原料效果更好。厨余-CN和玉米秸秆-NF组的最高产甲烷和产氢速率分别为42.4和26.5 mL·g-1VS·d-1。玉米秸秆-NF组的累积甲烷产量最高,为80.9 mL·g-1VS,分别比青稞秆-ZY、青稞秆-CN和厨余-CN组高出54.5%、255.4%和18.1%。玉米秸秆-NF组在产甲烷和产氢气方面均为最优,其次是厨余-CN组。

细菌Firmicutes和Bacteroidota在门水平上的相对丰度分别为35.3%～53.2%和11.6%～36.5%。NF接种物属水平上的优势细菌种为Proteiniphilum、Turicibacter、Fermentimonas和Lysinibacillus,相对丰度分别为16.2% 、12.6%、10.4%和9.0%。Euryarchaeota和Halobacterota在门水平上的相对丰度占总相对丰度的96.95%～99.95%。Methanosphaera和Methanocorpusculum、Methanobrevibacter分是CN和NF接种物中的优势菌种,相对丰度分别为98.2%和80.5%、18.6%。

不同接种物在属水上的细菌和古菌之间均存在较大显著性差异。产氢潜力受Turicibacter等10种细菌和Methanosphaera等2种古菌丰度的影响。产甲烷潜力与Proteiniphilum等17种细菌和Methanocorpusculu等9种古菌的相关。