木犀草素与青蒿琥酯联合用药防治实验性外伤性增生性玻璃体视网膜病变△

陈慈民 张 雨 陈美玲 徐柒华

外伤性增生性玻璃体视网膜病变(TPVR)是由眼外伤直接导致的增生性玻璃体视网膜病变(PVR)。外伤后,损伤的玻璃体视网膜修复产生增殖膜收缩,进一步牵拉视网膜,对患者视力及生活质量影响极大[1]。外伤患者常合并眼内炎、外伤性白内障及玻璃体积血等,TPVR进一步提高了病情复杂程度,当下手术治疗的技术难度大、脱离的视网膜完成解剖学复位但功能恢复不理想等都是需要解决的治疗难题[2]。目前常用的辅助用药为肾上腺皮质激素类药物曲安奈德,常用于术前玻璃体内注射防治PVR及辅助玻璃体显色[3]。然而,其对视网膜的毒性损害尚在争论之中,有研究报道曲安奈德玻璃体内注射可能增加青光眼及白内障的发生风险[4]。木犀草素(LU)是在木犀草中分离出的一种天然黄酮类化合物。LU具有抗炎、抗肿瘤等作用,其可降低炎症因子的表达,减少氧化应激诱导的细胞死亡,对视网膜具有保护作用[5]。青蒿琥酯(ART)是中药青蒿提取物的衍生物,在眼部可通过诱导血管内皮细胞凋亡,抑制角膜新生血管,发挥抗炎作用治疗葡萄膜炎[6-7]。近年关于PVR药物治疗的研究较多,如氨甲蝶呤[8]、柔红霉素[9]、吡非尼酮[10];中药提取物,如藏红花酸[11]、姜黄素、丹参单体和苦参碱[12]等,亦有两两药物联合,如蛋白激酶C抑制剂和褪黑素[13]、氟尿嘧啶联合萘普生[14]、抗肿瘤药物博来霉素相关药物[15]。然而既往许多药物实验存在阳性结果不明显或药物毒性较大等不足之处。因此,本次实验旨在通过建立动物实验性TPVR模型,向玻璃体内注射LU与ART联合药物,探讨其对TPVR的抑制效果,为临床治疗TPVR提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性成年青紫蓝兔16只,体重(约2.5 kg)、月龄(约8周)相近,由赣州市畜牧水产研究所[合格证号:SCXK(赣)2018-0009)]提供,实验前均行眼部检查排除眼部疾病。本实验已获得南昌大学附属眼科医院医学研究伦理委员会核查许可。

1.2 主要实验材料及仪器

LU(南京复苏生物科技有限公司);ART(北京索莱宝科技有限公司);加替沙星滴眼液(安徽省双科药业有限公司);B超机(Aviso);眼底照相机(NIDEK医疗器械贸易上海有限公司);PBS(Hyclone);蛋白酶抑制剂(翌圣生物科技上海股份有限公司);蛋白酶抑制剂混合物(武汉卡诺斯科技有限公司);MARKER(赛默飞世尔科技公司);一抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(杭州景杰生物科技股份有限公司);GADPH(杭州景杰生物科技股份有限公司);二抗Goat Anti-Rabbit IgG(ABMART医药科技上海有限公司);ECL化学发光检测试剂盒(Advansta);苏木精染液(MERCK);伊红染液(MERCK)。

1.3 动物TPVR模型建立及分组

兔耳碘伏消毒后,使用连接浅蓝色真空采血管(含38 g·L-1枸橼酸钠)的一次性采血针抽取足量实验兔耳动脉血,转入离心管中,置室温、1 500 r·min-1状态下离心,取体积上1/3上清液行血小板计数,获得血小板密度为(1.9～2.8)×1011个·L-1。将16只雄性青紫蓝兔使用简单随机抽样方法分为对照组、LU组、ART组及联合用药组(联合组),每组4只,均以右眼为实验眼。表面麻醉术眼,开睑器开睑后,于颞上方角巩膜缘后5 mm,15°穿刺刀向兔眼玻璃体中心部穿刺,造成长约2.5 mm的巩膜穿刺口,注意避开晶状体。随后使用1 mL注射器抽取 0.3 mL 玻璃体,更换注射器注入自体等量含血小板血浆。既往相关实验研究已证实该造模方法能够获取等级相近的TPVR模型[16]。术后1周内,术眼每日3次使用加替沙星滴眼液预防感染。造模3 d后,在实验眼的鼻上方角巩膜缘后5 mm分别向对照组注入0.2 mL生理盐水,LU组注入0.2 mL的LU(10 mg·L-1),ART组注入0.2 mL的ART(20 mg·L-1),联合组注入0.1 mL的LU(10 mg·L-1)及 0.1 mL的ART(20 mg·L-1),其中LU及ART的药物浓度分别参考既往相关实验文献[17]。

1.4 观察注药后玻璃体及眼底改变

注药后第4周,眼底照相、眼部B超检查观察16只术眼玻璃体及视网膜改变,并划分相对应的PVR等级,其中PVR等级按照1983年视网膜协会术语委员会划分的标准[18]进行分级(表1)。

表1 视网膜脱离与PVR的分级

1.5 Western blot检测注药后实验眼玻璃体内α-SMA表达情况

注药后第4周,深度麻醉给予实验兔“安乐死”后,各组随机取3只实验眼眼球。PBS清洗后,显微镜下分离玻璃体及视网膜至匀浆器,加入蛋白酶抑制剂数分钟后加入组织蛋白提取试剂,冰浴后,4 ℃、13 000 r·min-1状态离心5 min,收集上清液测定蛋白浓度。配好胶后拔出梳子,等量蛋白质加入样孔中,电泳至溴酚蓝距胶底3 mm左右后,将其转移至PVDF膜;转膜后放入体积分数5%脱脂牛奶中室温封闭1 h,后再将其转入一抗(α-SMA)中,4 ℃ 孵育过夜;后将膜置入TBST中清洗;转入二抗中,室温孵育30 min,将膜置入TBST中清洗;加ECL发光液并显影,Image pro plus分析结果。实验步骤重复3次。

1.6 观察注药后视网膜改变

注药后第4周,深度麻醉给予实验兔“安乐死”,立即取实验眼眼球1只置入体积分数10%甲醇溶液固定24 h,按照脱水、透明、浸蜡、包埋、切片顺序处理。切片使用二甲苯脱蜡,高浓度到低浓度酒精水化,HE染色,低浓度到高浓度去水化,中性树胶封片处理。

1.7 统计学处理

采用SPSS 27.0软件进行统计学分析,使用Graphpad prism 7.0绘制柱状图。计量资料以均数±标准差表示。PVR分级等级资料比较采用秩和检验。多组间比较采用单因素方差分析,组间差异比较使用Bonferroni检验。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 玻璃体及眼底改变

注药后第4周,眼部B超及眼底照相对各组术眼的观察结果提示,ART组术眼玻璃体少量混浊,视网膜尚平伏;LU组玻璃体混浊较重,视网膜面色素样改变,可见增殖膜及皱褶牵拉;联合组玻璃体清亮,视网膜平伏,表面见色素增殖性改变;对照组玻璃体混浊及视网膜脱离明显可见(图1)。注药后第4周,将各组PVR分级进行比较:ART组、LU组、联合组与对照组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);ART组、LU组与联合组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表2)。

表2 注药后第4周各组兔TPVR模型PVR分级

A:ART组眼底照相示视网膜表面平坦,左下角可见分散的色素;B:LU组眼底照相示玻璃体混浊,视网膜水肿,可见皱褶(黑色箭头处);C:联合组眼底照相示玻璃体清晰,可见色素增殖形式变化;D:对照组眼底照相示右上象限视网膜脱离突出;E:ART组眼部B超示玻璃体混浊伴轻微后脱离改变;F:LU组眼部B超示玻璃体混浊伴后脱离改变;G:联合组眼部B超示玻璃体透明;H:对照组眼部B超示玻璃体混浊,视网膜漏斗状脱离(黑色箭头处)。图1 注药后第4周各组兔TPVR模型眼底照相及眼部B超结果

2.2 玻璃体内α-SMA表达情况

Western blot检测结果显示,联合组玻璃体内α-SMA表达水平最低;联合组、ART组、LU组玻璃体内α-SMA表达水平均低于对照组,差异均有统计学意义(均为P<0.05);其中,联合组与LU组比较,差异有统计学意义(P<0.05),联合组与ART组比较,差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

2.3 HE染色结果

病理切片HE染色结果显示,对照组视网膜脱离,且视网膜水肿明显;联合组视网膜浅脱离,结构大体平整,损伤程度最轻;ART组视网膜脱离,但程度及结构紊乱程度不及对照组;LU组视网膜浅脱离,水肿较明显(图3)。

A:各组玻璃体内α-SMA表达情况;B:各组玻璃体内α-SMA表达水平比较柱状图。与对照组比较,*P<0.05;与联合组比较,#P<0.05。图2 注药后第4周各组兔TPVR模型玻璃体内α-SMA表达情况

A:ART组视网膜表面脱离,视网膜外层与脉络膜之间的结构不清晰;B:LU组视网膜脱离和视网膜外层结构紊乱;C:联合组视网膜为浅表脱离,结构相对完整;D:对照组视网膜脱离明显,水肿变化明显。图3 注药后第4周各组兔TPVR模型视网膜病理改变

3 讨论

眼外伤是造成目前全球单眼盲及低视力的主要原因之一,其发生原因以机械性创伤为主,发生人群以儿童和青中年人居多,致伤物常见于日常生活中的铁丝等金属异物,农业活动的板栗、竹子等农作物,玩具如子弹、鞭炮[19],或是战争冲突导致。机械性开放性损伤中,TPVR是常见并发症,视网膜脱离范围大、广泛的激光光凝、视网膜裂孔未关闭[20]、玻璃体积血及眼内炎症均增加其发病风险[21],因其玻璃体内创伤的修复严重程度不对等,瘢痕性修复使得治疗难度较大,这也是区别于一般PVR的原因之一[22-23]。TPVR特点包括血-视网膜屏障破坏,视网膜色素上皮(RPE)细胞、巨噬细胞[24]、Müller细胞[25]等的迁移,其肌纤维化样改变,进入玻璃体内,失去上皮形态[26],多种因子促使上皮-间质转化(EMT)改变,细胞外基质累积及增殖膜生成,视网膜形态扭曲[23]。

本研究中,LU组、ART组及联合组的眼部B超混浊程度、眼底视网膜病理化改变程度、TPVR分级程度及玻璃体内α-SMA水平均低于对照组,提示3组药物对TPVR均有抑制作用。LU及ART对TPVR的治疗结果与吴灵丹等[17]的研究结果相同。本研究中,联合组实验兔的眼部B超及眼底照相视网膜改变程度均优于单种药物组。联合组TPVR分级和α-SMA表达水平与LU组相比,差异均有统计学意义,提示联合用药的抗TPVR效果优于LU,联合组眼部B超较ART组清亮,TPVR分级优于ART组,但其α-SMA含量表达与ART组相比,差异未见统计学意义。究其原因,可能是ART较LU影响了更多有关于α-SMA表达的相关通路[17],导致联合应用时,LU的作用不明显,致使2组的α-SMA水平差异无意义。

RPE细胞之间的连接破坏,在转化生长因子、血管内皮因子等细胞因子的促增殖侵袭的诱导下经历了EMT过程,被认为是TPVR发病机制的重要部分[27],该过程涉及多种蛋白改变,如YES相关蛋白[28]、细胞骨架蛋白、创伤愈合/细胞黏附蛋白、上皮膜蛋白及氧化应激相关蛋白[29-30]。其中α-SMA作为典型的间充质细胞标志物[31],其增加提示EMT过程,其抑制提示间质上皮转化(MET)过程。此外,白藜芦醇可抑制转化生长因子诱导的EMT并通过去乙酰化果蝇母本抗生存因子蛋白Smad同源蛋白4信号通路诱导RPE细胞MET[32]。肉瘤基因Sarcoma(Src)激酶抑制剂CGP77675可抑制转化生长因子-β诱导的RPE细胞的EMT,也证实Src通路与EMT的相关性[33]。ART已被证实可通过抑制转化生长因子-β/Smad及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(Akt)途径信号通路抑制EMT,降低α-SMA的表达[34-35],LU可调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧化酶-1通路保护细胞免于氧化伤害,并通过Nrf2和Akt/糖原合成酶激酶3β途径缓解损伤后的EMT过程,降低α-SMA的表达[36]。本研究结果证明了LU和ART联合用药对TPVR疾病发展的抑制作用,且联合用药组的视网膜未见明显水肿、结构紊乱等改变,提示联合用药存在协同作用,有望成为防治TPVR的新疗法。

4 结论

LU与ART的联合用药能够有效抑制动物模型TPVR的发展程度,联合组实验兔的眼部B超及眼底照相显示视网膜改变程度均优于单种药物组。未来应进一步研究证实该联合用药的优越性,争取使其能够成为替代曲安奈德在眼部的治疗用药。目前,联合用药的具体协同机制尚不明确,后期可进一步研究其合用药理学、剂量、不良反应等方面,为治疗TPVR的研究打下基础。