新疆部分地区屠宰场羊源细粒棘球蚴分子鉴定及其遗传多样性分析

薛 文，王凌云，王云峰，张振杰，赵爱云，王 甜，齐 萌

（1.塔里木大学动物科学与技术学院/新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔843300；2.新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心，新疆 乌鲁木齐 830010）

细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）的中绦期幼虫——细粒棘球蚴，常寄生于人和多种动物的肝脏、肺脏等器官，导致机械性损伤、毒素作用和过敏反应，严重威胁畜牧业健康发展和公共卫生安全［1］。羊是细粒棘球蚴重要的中间宿主，感染率可达90%以上，该病原引起的疾病以囊型包虫病（cystic echinococcosis，CE）为主，是我国重点防治的人兽共患病之一［2］。羊感染细粒棘球蚴后，临床多表现为生长缓慢、发育不良、消瘦、咳嗽和肝炎等［3］。羊感染细粒棘球蚴的活体诊断较为困难，常采用屠宰时检查羊肝脏和肺脏中有无棘球蚴包囊作为确诊方法［4］。

基于细粒棘球蚴线粒体细胞色素C 氧化酶1（mitochondria cytochrome C oxidase subunit 1）基因（cox1）和NADH 脱氢酶1 （NADH dehydrogenase subunit 1）基因（nad1）的核酸序列分析发现，细粒棘球蚴有10 种基因型（G1～G10），不同国家或地区的基因型存在地理隔离分布和宿主适应性差异［5-6］。在新疆维吾尔自治区，羊感染细粒棘球蚴呈高发态势［7］。该研究旨在对新疆部分地区屠宰场羊源细粒棘球蚴进行分析鉴定和遗传特征分析，为羊包虫病的防治提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样本来源

于2020 年1 月—2022 年6 月，分别于新疆维吾尔自治区和静县、和硕县、轮台县、尉犁县、焉耆回族自治县、乌鲁木齐市米东区、吐鲁番市高昌区、托克逊县、特克斯县、昭苏县、新源县、伊宁县、吉木萨尔县、阜康市、木垒哈萨克自治县和呼图壁县共计16 个县（区）定点屠宰场采集96 份含细粒棘球蚴包囊的羊肝脏。将采集的肝脏样本装于采样袋中带回实验室使用蒸馏水将表面冲洗干净，用75%酒精进行擦拭，待提取基因组DNA。

1.1.2 主要试剂

组织基因组DNA 提取试剂盒（EasyPure Genomic DNA Kit）、2 × EasyTaq PCR SuperMix （+dye）、DNA Marker DL 2 000，均为北京全式金生物技术股份有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备

Sorvall Legend Micro 17 型微量离心机，Thermo Scientific 公司产品；MC proS PCR 仪，Eppendorf公司产品；DYY-7C 型稳压稳流电泳仪、JY 系列电泳槽，北京六一生物科技有限公司产品；Gel Doc XR+型凝胶成像系统，Bio-Rad 公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA 提取

对于无囊液的肝脏包囊样本，取黄豆大小的包囊囊壁用组织研磨器研磨，将100 μL 研磨好的组织样本按照组织基因组DNA 提取试剂盒说明书提取样本的基因组DNA；对于有囊液的肝脏包囊样本，用5 mL 无菌注射器抽取包囊液，将200 μL包囊液转入1.5 mL 离心管，按照组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取样本的基因组DNA。每份样本提取200 μL 的基因组DNA，置于-20 ℃保存，备用。

1.2.2 引物设计

参照Guo 等［8］的文献报道合成细粒棘球蚴线粒体cox1 基因PCR 扩增引物，参照Ohiolei 等［9］的文献报道合成细粒棘球蚴线粒体nad1 基因PCR 扩增引物，引物信息见表1，由苏州金维智生物科技有限公司合成。

表1 细粒棘球蚴线粒体cox1 基因和nad1 基因的PCR 扩增引物信息

1.2.3 目的基因的PCR 扩增

2 个基因位点的PCR 反应体系均为25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）12.5 μL；上、下游引物各0.3 μL；模板DNA 1 μL；ddH2O 10.9 μL。cox1 基因位点2 轮PCR 反应条件均为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变 性1 min，56 ℃退 火1 min，72℃延伸2 min，35 个循环；72 ℃最后延伸10 min。nad1 基因位点的PCR 反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃最后延伸10 min。PCR 扩增时，设置阳性对照与阴性对照，阳性对照为新疆羊源细粒棘球蚴基因组DNA，由塔里木大学兽医寄生虫学实验室鉴定保存，阴性对照为灭菌ddH2O。PCR 反应结束后，取5 μL 扩增产物，于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，在凝胶成像仪中观察结果。将阳性PCR 产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行双向测序。

1.2.4 序列分析

基于Chromas Pro（http：//technelysium.com.au/ChromasPro.html）对全部样本测序图谱进行序列校正及上、下游序列拼接；基于cox1 基因和nad1基因位点，分别将测序成功的序列用ClustalX 2.1软件（http：//www.clustal.org）进行比对，将比对校正后的序列在NCBI 的GenBank 数据库中进行同源性鉴定。利用Dna SP 5.10 软件（http：//.www.ub.es/dnasp）分别对该研究所获得的细粒棘球蚴cox1基因和nad1 基因序列进行单倍型分型。

1.2.5 种系发育分析

在GenBank 数据库中，下载细粒棘球绦虫以及多房棘球绦虫 （Echinococcus multilocularis）、少节棘球绦虫（Echinococcus oligarthra）、石渠棘球绦虫 （Echinococcus shiquicus）、狮 棘 球 绦 虫（Echinococcus felidis）等绦虫的mt-cox1 及mtnad1 基因组序列作为参考序列。在cox1 基因和nad1 基因位点，以泡状带绦虫（Taenia hydatigera）为外群。使用MEGA 7.0 软件（https：//megasoftware.net），采用最大似然法（maximum likelihood，ML）的时间可逆取代模型（general time reversible，GTR）构建系统进化树。进化树的可靠性用Bootstrap 分析进行检测，进行1 000 个重复。

2 结果与分析

2.1 屠宰场羊源细粒棘球蚴PCR 鉴定情况

采用PCR 法对96 份肉眼观察为细粒棘球蚴的基因组DNA 样本进行扩增，基于cox1 基因位点，扩增出目的条带的有81 份样本（84.37%，81/96），细粒棘球蚴cox1 基因的PCR 扩增结果见图1；基于nad1 基因位点，扩增出目的条带的有67份样本（69.79%，67/96），细粒棘球蚴nad1 基因的PCR 扩增结果见图2；结合2 个基因位点，共有91份样本扩增出目的条带（94.79%，91/96），在2 个位点同时扩增出目的条带的有57 份样本。

图1 细粒棘球蚴cox1 基因的PCR 扩增结果

图2 细粒棘球蚴nad1 基因的PCR 扩增结果

2.2 cox1 基因位点的序列分析与鉴定

cox1 基因位点序列比对分析结果显示，81 份阳性样本序列均属细粒棘球蚴G1 基因型（n=81）。基于Dna SP 5.10 软件分析显示，81 条序列存在15 个单倍型（Hap_1～Hap_15）。其中，Hap_3 为该研究优势单倍型，所占比例为71.60%（58/81），与我国西部地区绵羊源 （GenBank 登录号：OQ345777）、意大利牛源和羊源 （GenBank 登录号：ON606456、ON606453）的细粒棘球蚴序列同源性为100%。

Hap_15 有5 条序列，占比为6.17%（5/81）；Hap_1、Hap_4、Hap_8、Hap_10、Hap_14 分 别 有2条序列，占比均为2.47%（2/81）；Hap_2、Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_9、Hap_11、Hap_12、Hap_13 各有1 条序列，占比均为1.23%（1/81）。上述15 个单倍型彼此间碱基差异较小，其同源性为99.1%～99.7%。

2.3 nad1 基因位点的序列分析与鉴定

nad1 基因位点序列比对分析结果显示，67 份阳性样本序列鉴定出2 种基因型，分别为细粒棘球蚴G1 基因型（n=66）和G3 基因型（n=1）。基于Dna SP 5.10 软件分析显示，67 条序列存在19 个单倍型（Hap_1～Hap_19），其中，Hap_10 为该研究优势单倍型，所占比例为52.23%（35/67），与哈萨克斯坦、蒙古人源（GenBank 登录号：MG672257、MG672255），伊朗、阿根廷绵羊源（GenBank 登录号：MG672243、MG672253），巴西、智利牛源（Gen-Bank 登录号：MG672230、MG672221），墨西哥、阿根 廷 猪 源 （GenBank 登 录 号：MG672259、MG672208）的细粒棘球蚴序列同源性为100%。

Hap_3 有4 条序列，占比为5.97%（4/67）；Hap_2、Hap_8、Hap_17、Hap_19 分别有3 条序列，占比均为4.48%（3/67）；Hap_1、Hap_4、Hap_11 分别有2 条序列，占比均为2.99%（2/67）；Hap_5、Hap_6、Hap_7、Hap_9、Hap_12、Hap_13、Hap_14、Hap_15、Hap_16、Hap_18 各有1 条序列，占比均为1.49%（1/67）。上述19 个单倍型彼此间碱基差异较小，其同源性为99.5%～99.9%。

2.4 种系发育分析

根据cox1 基因位点序列构建的系统进化树可知，该研究所获新疆绵羊源细粒棘球蚴G1 基因型序列与参考株G1 基因型和G3 基因型序列聚类形成一个进化支，与其他基因型形成不同进化支。优势单倍型Hap_3 与我国四川省人源细粒棘球蚴序列（GenBank 登录号：AB786664）遗传距离较近，单倍型Hap_4～6、Hap_10～11、Hap_12～13 分别聚类成单独亚群，其他单倍型由于单核苷酸多态性各自形成小的独立分支，提示新疆绵羊源细粒棘球蚴在cox1 基因位点上呈现遗传多样性分布（见图3）。

图3 基于细粒棘球蚴cox1 基因位点构建的种系发育进化树

根据nad1 基因位点序列构建的系统进化树结果，该研究所获新疆绵羊源细粒棘球蚴G1 基因型和G3 基因型序列与参考株G1 基因型和G3 基因型序列聚类形成一个进化支，与其他基因型形成不同进化支。以G1 为流行基因型（Hap_1～13、Hap_15～19），而G3 基因型仅有1 个分离株，为单倍型Hap_14。优势单倍型Hap_10 与其他各单倍型基于单核苷酸多态性分别成为独立分支；Hap_14 与我国四川省人源细粒棘球蚴（GenBank登录号：KJ559023）遗传距离较近，归于同一进化分支上，提示新疆绵羊源细粒棘球蚴在nad1 位点上同样呈现遗传多样性分布（见图4）。

图4 基于细粒棘球蚴nad1 基因位点构建的种系发育进化树

3 讨论

世界范围内，羊感染细粒棘球蚴的病例均有报道，在以畜牧业发展为主的国家地区呈现高发流行态势。在伊朗开展的调查显示，不同养殖环境和调查点，羊细粒棘球蚴的感染率存在较大差异，感染率为5.1%～74.4%［10］。Guo 等［11］调查发现，新疆北疆4 个屠宰场的羊细粒棘球蚴感染率为3.5%（44/1 270），不同地区的感染率存在差异，以阿勒泰地区羊的感染率较高，为4.6%（9/196），乌鲁木齐市羊的感染率较低，为2.5%（13/518）。在克孜勒苏柯尔克孜自治州屠宰场检查羊、牛、牦牛等家畜脏器中发现，羊细粒棘球蚴携带率最高，为8.62%（283/3 283）［12］。Gao 等［13］统计分析 我 国1983—2020 年绵羊棘球蚴病的相关文献，发现我国绵羊棘球蚴平均感染率仍较高，为30.9%（192094/826 406），分析结果提示在高海拔、寒冷、潮湿、高降雨的地区，绵羊棘球蚴的感染率更高。我国新疆地区羊常见感染细粒棘球蚴，严重危害当地人类健康、公共卫生安全和畜牧业健康发展，应长期加强人和动物细粒棘球蚴病的监测和防治。

目前，细粒棘球绦虫分为10 种不同基因型（G1～G10），其中，G1 基因型和G2 基因型常见于绵羊；G3 基因型和G5 基因型常见于牛；G4 基因型常见于马；G6 基因型常见于骆驼科动物；G7 基因型和G8 基因型分别感染猪和鹿科动物；G9 基因型在波兰猪体内首次被发现；G10 基因型在亚欧大陆的驯鹿体内被发现［6，14-16］。Mehmood 等［14］研究发现，G1 基因型具有广泛的宿主范围和人兽共患风险，在羊和人之间易传播流行。在新疆地区，羊主要感染的是细粒棘球蚴G1 基因型，在伊犁哈萨克自治州、塔城地区和乌鲁木齐市等地发现羊还可感染G3 基因型［2，17-18］。Vural 等［19］对土耳其羊源细粒棘球蚴分离株样本进行PCR 扩增和序列分析，发现G1 型基因为优势感染基因型，同时发现感染G3 基因型。该研究对新疆部分地区81 条细粒棘球蚴cox1 基因序列进行分析，所有样本均为G1 基因型，存在15 个单倍型，不同单倍型之间存在多个单核苷酸差异，其中，优势单倍型与意大利、伊朗以及我国新疆维吾尔自治区、甘肃省等地牛源、羊源和人源的分离株基因序列同源性为100%。对67 条细粒棘球蚴nad1 基因序列进行分析，66 条鉴定为G1 基因型，1 条鉴定为G3 基因型，存在19 个单倍型，不同单倍型之间具有单核苷酸多态性，优势单倍型与非洲、南美洲、欧洲及亚洲的人、牛、羊和猪等多种动物源细粒棘球蚴基因序列同源性为100%［20］。上述研究结果表明，新疆部分地区羊源细粒棘球蚴具有遗传多样性分布特征和较有广泛的中间宿主范围，提示存在潜在的人兽共患风险，在流行地区应进一步加强细粒棘球蚴病的分子流行病学调查。

4 结论

新疆维吾尔自治区羊源细粒棘球蚴呈现遗传多样性分布特征，常见的基因型为G1 基因型。研究结果为我国羊的细粒棘球蚴感染情况调查和遗传进化特征分析提供了基础数据。