脑脊液ctDNA活检在髓母细胞瘤的研究进展*

陈欣彤 综述,盛汉松 审校

温州医科大学附属第二医院神经外科,浙江温州 325000

髓母细胞瘤(MB)是一种常见于儿童小脑或后颅窝的高侵袭性恶性肿瘤,占所有儿童颅内肿瘤的10%～20%。随着分子生物学的发展,MB根据基因表达谱至少可以分为4种分子亚型:WNT、SHH、Group3和Group4[1-2],近年来也有不少研究表明可将这些亚型分为更详细的亚组[3-4]。儿童MB主要根据分子亚型确定危险度分层及预后[2,5]。因此,MB的诊断、预后和治疗靶点的确定依赖于肿瘤的分子特征[2]。目前临床上主要通过组织活检来表征,但这种方式存在一定的局限性:由于其具有侵入性,组织活检的使用会受限于肿瘤的位置、大小等;通过随机和局部的组织活检获得的样本可能会遗漏肿瘤异质性;肿瘤基因组特征可能随着肿瘤发展而动态演变,在肿瘤治疗过程中或复发时,无法随时进行组织活检获取肿瘤信息,使临床诊疗的精确性受到限制[6-8]。循环肿瘤DNA(ctDNA)的脑脊液活检有可能克服上述局限,它能以一种侵入性较小的形式,通过识别和验证肿瘤生物标志物,提供实时信息以帮助诊断和监测中枢神经系统(CNS)恶性肿瘤[9]。在本综述中,笔者将概述脑脊液ctDNA活检在MB中的研究进展,讨论其潜在的临床应用价值及转化为临床实践工具需要克服的挑战。

1 脑脊液ctDNA

细胞游离DNA(cfDNA)是指由细胞脱落到生物体液中的DNA片段,其中由肿瘤细胞脱落的cfDNA即为ctDNA。ctDNA主要来自凋亡和坏死的肿瘤细胞,也可以由原发肿瘤中的任何细胞及其转移性病变释放[6]。多项研究表明脑脊液是ctDNA的可靠来源,在诊断CNS肿瘤方面比血浆或血清更有优势[10-11]。ctDNA可以根据健康细胞DNA中未发现的肿瘤特异性突变与cfDNA进行区分,提供高特异性的生物标志物。随着肿瘤的生长,细胞更新速率加快,释放出更多的ctDNA,因此ctDNA丰度的纵向监测为评估肿瘤负荷提供了可追溯的生物标志物,并且鉴于ctDNA的半衰期相对较短(约2 h),通过ctDNA分析实时监测肿瘤反应具有可行性[6,12]。

脑脊液ctDNA的检测过程主要为脑脊液样本收集,离心处理后通过核酸试剂盒提取与纯化DNA,继而采用ctDNA的检测和分析技术,如新一代测序(NGS)技术、数字聚合酶链反应(PCR)技术、BEAMing技术进行DNA测序,对肿瘤特异性遗传和表观遗传学改变(如基因突变、扩增、重排、甲基化等)进行定量分析[8,13-15]。目前,ctDNA常用检测方法主要分为靶向和非靶向两大类。靶向方法检测特定的、已知分子变化的靶向ctDNA,常使用基于PCR的技术或采用靶向基因测序,如数字PCR技术、BEAMing技术,能检测到极低水平ctDNA中的突变,灵敏度高,适用于初始诊断和分子肿瘤分类,但受到检测突变数量的限制;非靶向方法一般采用全基因组或全外显子组测序,如NGS技术,能同时检测多个基因的多种变异,也包括肿瘤分子谱未知的ctDNA突变,适用于分析播散和转移性肿瘤随时间变化的基因组表现[6,16-18]。

2 ctDNA脑脊液活检用于诊断MB的临床价值

2.1辅助MB诊断、分类及预后预测 脑脊液ctDNA的突变能高度体现肿瘤组织的基因型,可用于肿瘤的病理分型,协助诊断MB,并通过分子分型结合患者年龄、手术切除程度、有无转移、组织病理类型辅助对MB的危险度进行分层[2],进而预测MB患者的预后。MB亚组主要通过分析与其相关的突变基因(BCOR、CTDNEP1、CTNNB1、DDX3X、GFI1、GFI1 act、GFI1B act、KBTBD4、KDM6A、KMT2C、KMT2D、PRDM6 act、PTCH1、SMARCA4、SMO、SUFU、TERT、TERT启动子、TP53、ZMYM3等)、染色体拷贝数变异(CNV,包括GLI2、MYC、MYCN、OTX2扩增,PTEN、SUFU 缺失等)及细胞遗传学特征(如1q+,2+,4-,5+,6-,7+,8-,8+,9p+,9q-,10-,10q-,11-,13-,13+,14+,14q-,15-,16-,16q-,17p-,17p+,18+,21-)进行分类[10,19]。ESCUDERO等[10]研究表明脑脊液ctDNA概括了原发性肿瘤中存在的肿瘤内异质性及肿瘤突变负荷,对于脑脊液细胞学结果阴性的患者,脑脊液中的ctDNA水平比血浆中的更高,并且脑脊液ctDNA的外显子组测序发现在原发性肿瘤样本中检测到的突变也可以在匹配的脑脊液ctDNA中检测出,二者的变异等位基因频率具有显著相关性。研究中检测到的基因组改变包括MB常见突变(PTCH1、TP53)、CNV(MYCN和GLI2扩增)和臂级染色体畸变(染色体17p丢失),表明ctDNA分析能为MB分子诊断与危险度分层提供充足的信息。LIU等[20]利用MB染色体不稳定性的优势将脑脊液cfDNA中CNVs作为可测量残留病灶(MRD)标志物,在67例基线样本[63.81%(67/105)]中检测到MRD,且与相应的原发性肿瘤CNV谱呈高度相关。此外,有研究发现基线样本中MRD的可检测性与年龄、性别、切除范围、细胞学表现及从切除到脑脊液取样的持续时间无关,但与MB风险分组、转移状态、分子亚组和肿瘤位置显著相关,这些因素又具体表现在MB的危险度分层中[20-21]。脑脊液ctDNA辅助MB诊断与危险度分层,继而为MB的预后提供预测信息,有研究表明虽然基线MRD的可检测性无显著预后价值,但放疗后、化疗中期或治疗结束时的连续MRD评估与患者的无进展生存时间显著相关,无论初始风险分组如何,在辅助治疗期间或结束时持续的MRD阳性能高度预测疾病进展情况,反之,早期(例如在放疗后的时间点)MRD阴性则可以作为治疗降级的附加标准[20]。因此,相较于传统的组织活检分析分子特征的方法,脑脊液ctDNA能较全面、动态地反映肿瘤的基因组特征,从而辅助MB的诊断、分类与预后预测。

2.2监测治疗反应、肿瘤进展与复发 在患者随访期间,通过监测ctDNA水平和MRD,有助于评估治疗反应与肿瘤进展。ESCUDERO等[10]通过纵向分析脑脊液ctDNA、检测MRD,确定了肿瘤内和病灶间的异质性,揭示了肿瘤在复发时的基因组转化;通过对MB患者术前、术后及随访时的脑脊液ctDNA分析发现,在治疗结束时脑脊液样本中仍然观察到少量ctDNA,表明脑脊液ctDNA分析可以检测到患者体内残留的小结节,并且在部分通过磁共振成像未观察到的样本中也能检测到。LIU等[20]研究发现,50%的患者通过MRD检测到的病情进展比放射学检测到的早3个月以上,即MB中ctDNA的增加先于放射学进展,表明脑脊液ctDNA可以弥补影像技术检测的滞后性,促进MB患者中MRD的鉴定。

MB复发或转移的患者,脑脊液ctDNA中检测到的MB相关改变比来自肿瘤组织的基因组DNA更丰富,具有与原发肿瘤不共有的分子谱[10,20-21]。ESCUDERO等[10]分析脑脊液ctDNA发现,除检测到肿瘤特异性突变(常见的4个预测驱动因素包括PTCH1:p.L1024Pfs,TP53:p.N239Tfs,CDKN2B:p.G124D,KMT2A:p.W1199S)外,还检测到其他突变,揭示了复发时肿瘤的基因组转化。LIU等[20]对有疾病进展及在早期时间点与疾病进展时MRD均阳性的患者进行脑脊液与肿瘤样本匹配的CNV谱分析发现,80.00%患者(12/15)的染色体非整倍性存在,提示染色体克隆选择或进化,其中2例患者在原发肿瘤与基线ctDNA比较的亚群中检测到不同CNV谱,并且ctDNA的CNV谱与复发肿瘤更一致,提示患者基线时的脑脊液样本包括驱动疾病进展的侵袭性亚克隆。因此,ctDNA分析可能更真实地代表最终驱动疾病进展的恶性细胞基因组信息,对肿瘤进展与复发的诊断有补充作用,有助于在复发时调整治疗策略。

MB还呈现异常DNA甲基化改变的表观遗传学特征[7],脑脊液ctDNA分析可以检测到具有诊断和预后价值的DNA甲基化标志物。LI等[22]分析了MB患者脑脊液ctDNA基因组中的表观遗传标志,包括DNA甲基化和羟甲基化,表明脑脊液ctDNA还可以进行表观遗传学分析,在ctDNA中鉴定的DNA甲基化标志具有潜在的诊断和预后价值,并且脑脊液样品中的DNA甲基化的变化可用于监测治疗反应和肿瘤复发。

3 ctDNA脑脊液活检用于诊断MB面临的挑战

首先是脑脊液获取方面的挑战。脑积液抽取在患有后颅窝肿瘤(如MB)的儿童中较为常见,需在手术治疗前进行脑脊液外引流以减轻颅内压,并在MB临床诊疗过程中,常规收集脑脊液样品用于细胞学分析,因此脑脊液样本的获取对MB患儿一般不会造成额外伤害,且获取脑脊液的侵入性明显低于手术。但通过腰椎穿刺的方式获取脑脊液也存在一定限制,其禁忌证包括颅内压异常、脑疝风险和凝血异常等[9]。

其次,收集和处理脑脊液ctDNA的方法尚需标准化和优化[23],如样本采集的日期,尤其是术后采集日期,因为创伤诱导的cfDNA在手术后长达4周内丰度可能会稀释ctDNA的比例,进而影响检测结果[24];样本量也会影响ctDNA的检测结果[6];温度、储存条件等因素会影响ctDNA的完整性[25]。

此外,ctDNA并未在所有CNS恶性肿瘤患者的脑脊液中检测到,其检测结果可能受肿瘤负荷、肿瘤进展和解剖位置的影响[20-21],尚需进一步扩大研究范围、确定检测涉及的影响因素以及提高检测技术的敏感性[9]。影像学检查技术有时反映出的“肿瘤进展”可能是治疗引起的炎症反应过程,即假性进展[26],尚需进一步的研究来调查脑脊液ctDNA分析是否有助于区分真实进展和假性进展。

4 总结与展望

目前肿瘤分子特征的分析已成为确定MB类型、预后以及治疗靶点的重要组成部分。脑脊液ctDNA分析从降低侵入性、更全面反映肿瘤异质性、样本获取的方便性等方面弥补了组织活检的不足,对MB的临床管理有潜在价值。脑脊液ctDNA分析可以反映MB的基因组特征,辅助MB早期、准确的分子诊断(包括亚型和危险度分层)与预后预测,脑脊液ctDNA分析还可以动态监测患者的疾病进展,提供有关MRD、肿瘤演变和复发时的基因组信息。但ctDNA脑脊液活检尚面临处理方法标准化、检测技术优化等方面的挑战,因此有必要进行更大队列的研究,从优化检测技术、确立活检的纳入、处理与分析标准等方面解决脑脊液ctDNA分析向临床转化的困难,最终为MB患者提供更便捷、精准的临床管理等医疗服务。