连续3 a生草对苹果园土壤理化性质及微生物群落的影响

姜莉莉,孙瑞红,张甘雨,张文升,宫庆涛,武海斌

(山东省果树研究所,山东泰安 271000)

果园土壤管理是果业生产的重要环节。行间生草是近年来国内兴起的果园管理新模式,改变了传统的果园清耕管理方式[1]。大量研究表明,果园生草有利于改善果园生态环境,改良土壤结构[2],促进保水保土[3],增加土壤有机质及各种养分元素含量[4],提高果园综合效益[5]。

不同生草制度对果园土壤的改良效果存在明显差异[6]。目前果园生草有自然生草和人工种草2种模式。王艳廷等[7]报道,自然生草能够降低黄河三角洲果园土壤的含盐量,提高有机质含量。秦景逸等[8]报道,与清耕相比,苹果园间作红豆草、紫花苜蓿等绿肥可提高土壤速效氮、速效磷和有机质含量。杨野等[9]报道,苹果园种植黑麦草可使土壤速效磷和速效钾含量分别较对照增加82.1%和20.4%。

长柔毛野豌豆(ViciavillosaR.)属于1a生豆科植物,其有冬小麦特性,春季迅速爬蔓生长、覆满地面,具有涵养水源的作用,在果园生草中应用较广[10]。白三叶(TrifoliumrepensLinn)又名白车轴草,其茎叶细软、匍匐生长特性强,被广泛用于水土保持、园林绿化及果园生草[11]。黑麦草(LoliumperenneL)属禾本科1a生或多年生优良牧草,具有培肥土壤的作用[12]。

本研究以自然生草(Natural Grass, NG)为对照,研究苹果园行间连续3a种植黑麦草(LoliumperenneL., LPL)、白三叶(TrifoliumrepensLinn., TRL)和长柔毛野豌豆(ViciavillosaR., VVR)对土壤微生物群落结构及碱解氮(Alkali-hydrolyzable nitrogen,AN)、有效磷(Available phosphorus,AP)、速效钾(Available kalium,AK)、有机质(Organic matter,OM)和pH的影响,并进行相关性分析,以期为果园生草制度的科学制定和果园种植业的绿色健康发展提供理论 依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验区位于山东省聊城市阳谷县苹安耶果农业科技有限公司矮砧立架密植苹果园(36°10′54″N,115°54′3″E)。试验地南北向,地势平坦,地貌、土质等自然条件基本一致。土壤为砂壤土,pH 7.8。供试苹果为2 a生‘烟富三号’,砧木为M9T337,株行距为1 m×3.5 m。自然生草群落为稗草、马唐、狗尾草、蒲公英、马齿苋及苦荬菜等。

园区肥水措施基本一致,2017-2020年,每年采收后秋施有机肥500 kg/667m2(含有机质40%,芽孢杆菌0.2 亿/g)。通过水肥一体化追肥处理见表1。

表1 试验果园追肥记录

1.2 试验设计

采用单因素随机区组试验设计,以自然生草为对照,设置种植黑麦草(LPL)、白三叶(TRL)和长柔毛野豌豆(VVR)3个人工生草处理。每个处理重复3次,每个小区面积350 m2。分别于2017年、2018年和2019年10月进行行间机械播种,播种密度22.5 kg/hm2,播种深度1～2 cm,各处理的生态条件及苹果的田间管理措施一致。

1.3 样品采集

分别于2018、2019和2020年苹果采收后施基肥之前进行土壤采样。在各小区两行树间均匀布设15～20个采样点,清除表层凋落物,用土钻采集5～15 cm土层土样。将每个处理的土样充分混匀,去除根系等杂质,过1 mm筛后分成2份。一份经液氮冻干处理后,以干冰保存并送样,用于测定土壤微生物群落结构;另一份风干后,用于土壤理化性质分析。

1.4 土壤微生物群落结构分析

土壤微生物群落结构的高通量测序分析由北京诺禾致源科技股份有限公司代理完成。

提取样本基因组 DNA 并检测纯度和浓度后,以无菌水稀释至1 ng/μL。以此为模板,分别采用带Barcode的引物515F/806R和ITS5-1737F/ITS2-2043R进行16S和ITS区域PCR扩增,用于鉴定细菌和真菌多样性。

PCR产物经电泳检测和酶标定量,根据浓度进行等量混样,以2%的琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的条带。构建文库,经过Qubit和Q-PCR定量检测合格后,使用NovaSeq 6000进行上机测序。

拆分出样本数据,截去Barcode和引物序列,进行数据质控,去除嵌合体序列,得到最终有效数据。利用Uparse算法进行聚类分析,以97%的一致性将序列聚类成为OTUs。依据其算法原则,筛选出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs序列进行物种注释,用Qiime软件(v1.9.1)中的blast方法与Unite(v8.2)数据库进行物种注释分析,并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。得到所有OTUs代表序列的系统发生关系。以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理,并基于此进行后续的Alpha和Beta多样性分析。

使用Qiime软件计算Observed-otus,Chao1,Shannon,Simpson,ace,Goods-coverage,PD_whole_tree 指数,使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线。进行Spearman相关性分析,以pheatmap函数进行可视化。

1.5 土壤理化性质测定

土壤碱解氮(Alkali-hydrolyzable nitrogen,AN)含量测定方法采用碱解扩散法,有效磷 (Available phosphorus,AP)含量测定采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法,速效钾(Available kalium,AK)含量测定采用醋酸铵浸提-火焰光度法。土壤pH测定采用电极电位法,有机质(Organic matter,OM)含量测定采用水合热重铬酸钾氧化-比色法[13]。

1.6 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 18.0进行数据统计分析,并进行Duncan’s差异显著性分析和Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 连续3 a生草处理对果园土壤理化性状的影响

由表2可以看出,随着生草时间的延长,除有效磷外,各生草处理的土壤养分含量总体呈上升趋势,pH呈下降趋势。连续生草3 a,白三叶和长柔毛野豌豆处理的苹果园土壤碱解氮含量均显著提高,分别由2018年的18.38 mg/kg和42.26 mg/kg提升至2020年的70.16 mg/kg和61.94 mg/kg;黑麦草和长柔毛野豌豆处理的土壤速效钾含量均显著提高;黑麦草、白三叶和长柔毛野豌豆处理的土壤有机质含量均显著提高;自然生草处理的土壤养分含量随着生草年限的延长呈现波动趋势。

表2 连续3 a生草处理的苹果园土壤理化性状

2.2 连续3 a生草对果园土壤微生物多样性指数的影响

2.2.1 连续3 a生草处理对果园土壤细菌多样性指数的影响 由表3可以看出,连续3 a生草,各生草处理的土壤细菌Shannon和Simpson指数差异不大, Chao1和ACE指数呈先上升后下降的趋势,且3个人工生草处理的Chao1和ACE指数整体高于自然生草处理。

表3 连续3 a生草处理土壤细菌多样性指数的变化

2.2.2 连续3 a生草处理对果园土壤真菌多样性指数的影响 由表4可以看出,连续生草3 a,自然生草(NG)处理的真菌Shannon指数变化不大,3个人工生草处理的Shannon指数随着年份的推移逐渐下降。其中长柔毛野豌豆(VVR)处理的下降幅度最小,由7.77降至6.91,白三叶处理降低幅度最大,由7.24降至4.65。各处理Simpson指数总体差异不大。长柔毛野豌豆处理的Chao1和ACE指数整体高于其他处理。

表4 连续3 a生草处理土壤真菌多样性指数的变化

2.3 连续3 a生草处理对果园土壤微生物群落结构的影响

2.3.1 连续3 a生草处理对果园土壤细菌相对丰度的影响 由图1可以看出,连续3 a生草处理,各处理的芽孢杆菌Bacillus相对丰度呈下降趋势,鞘氨醇单胞菌Sphingomonas相对丰度整体呈上升趋势,溶杆菌Lysobacter呈先上升后下降趋势。

A.Acidibacter酸杆菌;B.Bacillus芽孢杆菌;C.Subgroup_10未识别;D.Sphingomonas鞘氨醇单胞菌;E.Bryobacter未识别;F.unidentified_Chloroplast未识别叶绿体;G.Lysobacter溶杆菌;H.UTCFX1未识别;I.RB41未识别;J.MND1未识别

2.3.2 连续3 a生草处理对果园土壤真菌相对丰度的影响 由图2可以看出,连续生草处理 3 a,白三叶(TRL)和长柔毛野豌豆(VVR)处理可显著提高果园土壤木霉属Trichoderma真菌的相对丰度。黑麦草(LPL)、白三叶和自然生草(NG)可在一定程度上提高果园土壤白粉菌属Blumeria的相对丰度。

A.Battarrea未识别;B.Fusarium镰刀菌属;C.Sarocladium帚枝霉属;D.Mortierella被孢霉属;E.Mycena小菇属;F.Ramicandelaber未识别;G.Conocybe锥盖伞属;H.Unidentified未识别;I.Blumeria白粉菌属;J.Trichoderma木霉属

2.4 果园生草处理土壤微生物相对丰度与理化性质的相关性

2.4.1 果园生草处理土壤细菌相对丰度与理化性质的相关性 由图3可以看出,在生草条件下,苹果园土壤气单胞菌属Arenimonas相对丰度与有效磷(AP)呈显著正相关;青枯菌属Ralstonia相对丰度与有效磷和pH呈显著正相关;鞘氨醇单胞菌Sphingomonas相对丰度与pH呈显著负相关;芽孢杆菌Bacillus相对丰度与有效磷呈显著正相关,与pH呈极显著正相关;溶杆菌Lysobacter相对丰度与有效磷呈显著正相关。

A.Nocardioides类诺卡氏属;B.Opitutus丰佑菌属;C.Flavobacterium黄杆菌属;D.Unidentified_Vicinamibaceriaies未识别;E.Pir4_lineage未识别;F.Ohtaekwangia未识别;G.Skermanella未识别;H.Solirubrobacter未识别;I.AKYG587未识别;J.SWB02未识别;K.Arenimonas气单胞菌属;L.Polycyclovorans未识别;M.Microvirga微小杆菌;N.Hassallia未识别;O.Arthrobacter节细菌属;P.Adhaeribacter未识别;Q.Ralstonia青枯菌属;R.Terrimonas未识别;S.Ramlibacter分枝菌;T.Ellin6067未识别;U.Sphingomonas鞘氨醇单胞菌;V.Pirellula小梨形菌属;W.Dongia未识别;X.Steroidobacter未识别;Y.Bacillus芽孢杆菌;Z.Gaiella未识别;AA.Haliangium未识别;AB.Acidibater酸杆菌;AC.Subgroup_10未识别;AD.Bryobacter未识别;AE.unidentified_Chloroplast未识别叶绿体;AF.Lysobacter溶杆菌;AG.UTCFX1未识别;AH.RB41未识别;AI.MND1未识别

2.4.2 果园生草处理土壤真菌相对丰度与理化性质的相关性 由图4可以看出,链格孢属Alternaria相对丰度与pH呈显著正相关,巨孢囊霉属Gigaspora相对丰度与速效钾(AK)呈显著正相关,与碱解氮(AN)呈极显著正相关,与pH呈显著负相关,与有效磷呈极显著负相关;刺盘孢属Colletotrichum相对丰度与有机质(OM)呈显著负相关,与速效钾呈极显著负相关;葡萄穗霉属Stachybotrys相对丰度与有机质呈显著负相关;假裸囊菌属Pseudogymnoascus相对丰度与pH呈显著正相关;帚枝霉属Sarocladium相对丰度与速效钾呈显著负相关;锥盖伞属Conocybe相对丰度与有效磷呈显著正相关,与碱解氮呈显著负相关;被孢霉属Mortierella相对丰度与pH呈显著正相关;白粉菌属Blumeria相对丰度与碱解氮呈极显著正相关,与有效磷呈极显著负相关。

3 讨 论

3.1 果园生草对土壤肥力的影响

中国果园面积位居世界首位,早在1998年便将果园生草作为绿色果品生产的主要技术措施在全国推广[14]。吴家森等[15]和钱进芳等[16]报道,山核桃林生草能够有效提高土壤养分含量和微生物功能多样性,促进土壤修复。岳泰新等[17]报道,行间生草可以改善葡萄园土壤的微生物学指标,其中以白三叶和紫花苜蓿效果较为明显。王倩等[18]报道,旱地苹果园生草覆盖可以显著提高土壤有机质含量和微生物数量。孙计平等[19]报道,长期生草可以有效增加梨园表层土壤的微生物数量和腐殖酸含量。

生草模式和草种选择是果园生草成功的前提和基础[20]。钱雅丽等[21]报道,陇东旱作果园种植鸭茅Dactylisglomerata可以促进土壤氮素积累,种植白三叶和紫花苜蓿Medicagosativa的芽孢杆菌相对丰度较高。Wang等[22]报道,人工种植白三叶处理对果树根际微生物增殖和碱解氮积累的促进效果高于自然生草。Pott等[23]报道,覆盖植物长柔毛野豌豆可以降低作物对土壤氮素养分的消耗,且在一定程度上提高作物产量。

同一生草模式的不同生草年限对土壤养分及微生物群落结构的影响也并不完全相同。付学琴等[24]报道,南丰蜜橘园自然生草2 a碱解氮、速效磷、速效钾含量明显低于清耕对照,而生草8 a则较对照增加了25.98%、3.1%和90.57%。王艳廷等[7]报道,梨园自然生草处理4 a的土壤碳源利用高于生草6 a和9 a处理。

本研究以自然生草为对照,系统评价连续3 a种植黑麦草、白三叶和长柔毛野豌豆处理对土壤微生物群落结构及理化性质的影响。发现随着生草年限的延长,各生草处理的土壤碱解氮、速效钾及有机质含量总体呈上升趋势,pH呈下降趋势。连续生草3 a,白三叶和长柔毛野豌豆处理的苹果园土壤碱解氮含量均显著提高,其中白三叶处理的碱解氮含量由2018年的18.38 mg/kg提升至2020年70.16 mg/kg,这可能与豆科植物的固氮作用有关;黑麦草和长柔毛野豌豆处理的土壤速效钾含量均显著提高;人工生草处理的土壤有机质含量显著提高;自然生草处理的土壤养分含量随着生草年限的延长波动较大,这可能与覆盖植物种类及覆盖度变化有关。

3.2 果园生草对土壤微生物群落的影响

土壤微生物是陆地生态系统的重要组成部分,其参与调节大部分土壤生物化学过程,在养分循环中发挥着重要作用[25]。微生物多样性指数、优势度指数、均匀度指数和丰富度指数是表征群落多样性的常用指数,可以揭示土壤微生物种类和功能的差异[26]。Shannon和Simpson指数主要反映样品中物种分布的多样性和均匀度,群落多样性越高,物种分布越均匀,Shannon和Simpson指数越大。Chao1指数主要用于估计样品中包含的物种总数[27]。ACE指数反映了样品中物种的丰度和物种在样品中出现的概率[28]。

姚城城等[29]报道,自然生草能够提高苹果园土壤细菌多样性,改良群落结构和组成。徐惠昌等[30]报道,栗园种植鼠茅草可促进土壤红菇属的增殖,光叶紫花苕可促进粒毛盘菌属和单顶孢属的增殖。本研究发现,对细菌而言,苹果园连续 3 a生草,各处理的土壤Shannon和Simpson指数差异不大, 3个人工生草处理的Chao1和ACE指数整体高于自然生草处理;对真菌而言,自然生草处理的真菌Shannon指数随生草年限变化不大,3个人工生草处理的Shannon指数随着年份的推移逐渐下降,长柔毛野豌豆处理的Chao1和ACE指数整体高于其他处理。可见人工生草对土壤细菌的多样性和均一性影响不大,但在一定程度上降低真菌的多样性和均一性,长柔毛野豌豆处理可在一定程度上提高苹果园土壤的真菌 总数。

微生物相对丰度分析发现,连续3 a生草处理,各处理的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas相对丰度整体呈上升趋势,溶杆菌Lysobacter呈先上升后下降趋势;白三叶和长柔毛野豌豆处理可显著提高果园土壤木霉属Trichoderma真菌的相对丰度;黑麦草、白三叶和自然生草可在一定程度上提高果园土壤白粉菌属Blumeria的相对丰度。总体比较可以发现,长柔毛野豌豆生草处理可在一定程度上提高鞘氨醇单胞菌、木霉菌等有益菌的相对丰度,但对白粉菌等有害菌不表现刺激作用,对果园土壤微生态环境有益。

土壤微生物相对丰度与理化性质的相关性分析发现,青枯菌属Ralstonia与有效磷和pH呈显著正相关;鞘氨醇单胞菌Sphingomonas与pH呈显著负相关;芽孢杆菌Bacillus与有效磷呈显著正相关,与pH呈极显著正相关;溶杆菌Lysobacter与有效磷呈显著正相关;链格孢属Alternaria相对丰度与pH呈显著正相关;白粉菌属Blumeria相对丰度与碱解氮呈极显著正相关,与有效磷呈极显著负相关。同时,刺盘孢属Colletotrichum相对丰度与有机质呈显著负相关,与速效钾呈极显著负相关;葡萄穗霉属Stachybotrys相对丰度与有机质呈显著负相关。可见,在生草条件下,适当提高果园土壤有效磷含量、降低pH,可在一定程度上降低青枯菌、白粉菌等病原菌的相对丰度,提高芽孢杆菌、溶杆菌等有益菌的相对丰度;适当提高土壤有机质含量,可在一定程度上降低刺盘孢属、葡萄穗霉属等病原菌的相对丰度,进一步改良土壤微生态环境。

4 结 论

土壤理化性状测定发现,苹果园连续生草 3 a,可显著提高果园土壤养分含量、降低土壤pH。其中长柔毛野豌豆处理可以显著提高土壤碱解氮、速效钾含量,白三叶处理可以显著提高碱解氮含量,黑麦草处理可以显著提高土壤速效钾含量。

微生物相对丰度分析发现,长柔毛野豌豆生草处理可在一定程度上提高鞘氨醇单胞菌、木霉菌等有益菌的相对丰度,对果园土壤微生态环境有益。

相关性分析发现,在生草条件下,适当提高果园土壤有效磷和有机质含量及降低pH,可在一定程度上降低青枯菌、白粉菌、刺盘孢属、葡萄穗霉属等病原菌的相对丰度,提高芽孢杆菌、溶杆菌等有益菌的相对丰度,有助于改良土壤微生态 环境。