连贯抗病毒颗粒的HPLC指纹图谱研究及含量测定*

陆杰霖，郭曼曼，殷文娟，钱叶飞，汪 怡**

1昆山市中医医院，昆山 245347；2苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215104

流行性感冒是流感病毒引起的一种急性呼吸道感染，在中医学被称为“时行感冒”，属疫疠类（即传染病）[1]。医院制剂连贯抗病毒颗粒由连翘、贯众、香薷及青蒿组成，具有疏表达邪、清热解毒之功效，治疗病毒性感冒、支气管炎、肺炎及病毒感染性疾病。连翘药理结果表明，其具有抗甲型流感病毒作用，也有很好的抗呼吸道合胞病毒的作用[2-4]；绵马贯众能降低感染FM1 株流感病毒的小鼠肺指数，降低病毒引起的肺损伤[5]；香薷及青蒿也有相似的抗流感病毒活性，能减轻小鼠肺部的病变[6，7]。

目前，该制剂的质量标准仅检测酸碱度、密度等，无法适应现代中药制剂对质量控制的要求。本文采用HPLC 法建立连贯抗病毒颗粒的指纹图谱，同时测定了制剂中咖啡酸、连翘酯苷A 及连翘苷的含量，提升院内制剂质量控制水平。

1 仪器与试药

e2695 型色谱系统（美国沃特世公司）；BT25S型分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

咖啡酸（MUST-22062118）、芦丁（MUST-22022507）、连翘酯苷A（MUST-22033105）、连翘苷（MUST-22042111）对照品均购于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均≥98%。10 批次连贯抗病毒颗粒均由昆山市中医医院制剂室提供，样品编号（批号）分别为LG1（20211120）、LG2（20211125）、LG3（20220106）、LG4（20220120）、LG5（20220304）、LG6（20220501）、LG7（20220508）、LG8（20220707）、LG9（20220725）、LG10（20220801）。甲醇、乙腈为色谱纯；其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 试液与条件

供试品溶液：取装量差异下的本品，研细，取约2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加稀乙醇25 mL，称重，超声处理（功率600 W，频率40 kHz）30 min，冷却至室温，再用稀乙醇补足失量，摇匀，高速离心，取上清液，过0.45 μm 有机滤膜，取续滤液。

对照品溶液：分别取连翘酯苷A、连翘苷、芦丁、咖啡酸对照品适量，精密称定，加稀乙醇配制成浓度 分别为4 938.13、3 386.88、133.40 和648.83 μg·mL-1的对照品储备液。

色谱条件：YMC-Pack Pro C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相A 为乙腈，流动相B 为0.2%甲酸水，性线梯度洗脱（A∶B）：0 min（10∶90）→15 min（10∶90）→60 min（16∶84）→90 min（28∶72）→110 min（70∶30）；柱温35℃；检测波长280 nm。

2.2 指纹图谱方法学考察

2.2.1 进样精密度试验 取编号LG8 样品供试品溶液，连续进样6 次，以连翘酯苷A 为参照峰，记录并计算得各共有峰相对保留时间RSD ＜0.77%（n=6），相对峰面积RSD ＜4.98%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验 取编号LG8 样品供试品溶液共6 份，进样测定，以连翘酯苷A 为参照峰，记录并计算得各共有峰相对保留时间RSD ＜0.97%（n=6），相对峰面积RSD ＜4.77%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.2.3 稳定性试验 取编号LG8 样品供试品溶液，于0、4、8、12、16、20 h，进样测定，以连翘酯苷A 为参照峰，记录并计算得各共有峰相对保留时间RSD ＜0.73%（n=6），相对峰面积RSD ＜4.80%（n=6），表明供试品溶液在20 h 内稳定性良好。

2.3 连贯抗病毒颗粒的HPLC 指纹图谱建立

2.3.1 指纹图谱建立 取10 批连贯抗病毒颗粒适量，按上述方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进行测定，记录色谱图，将色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件中，将S1 设置为参照图谱，时间宽度设定为0.10 min，采用中位数法，进行Mark 峰匹配，得到10 批HPLC 指纹图谱叠加图，见图1。

图1 10 批连贯抗病毒颗粒HPLC 叠加图谱

2.3.2 连贯抗病毒颗粒相似度分析 使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 版）对10 批连贯抗病毒颗粒的色谱图谱进行处理，计算各样品图谱与对照指纹图谱的相似度。结果S1～S10 的相似度分别为0.985、0.992、0.976、0.963、0.948、0.999、0.953、0.987、0.924、0.964，10 批次制剂相似度均＞0.92，说明10 批连贯抗病毒颗粒指纹图谱有较好的相似性，生产稳定性较好。

2.3.3 共有峰的标定与归属 对10 批样品图谱进行分析，其中连翘酯苷A 紫外响应明显，色谱保留时间适中，且为处方中主要活性成分，故以其为参照峰（s），10 批次连贯抗病毒颗粒的13 个共有峰的保留时间及相对峰面积见表1。共标定了13 个共有峰，通过相对保留时间和紫外光谱与对照品一致的比较，指认出4 号峰为咖啡酸、6 号峰为芦丁、8 号峰为连翘酯苷A，13 号峰为连翘苷，见图2。

表1 10 批次连贯抗病毒颗粒各峰保留时间及相对峰面积（n=10）

图2 连贯抗病毒颗粒指纹图谱共有模式图

分别取连翘、香薷、贯众、青蒿单味药，按照处方工艺制备单味药对照品。按“2.1”项下方法制备单味药对照品溶液，按“2.1”项下条件进行测定，记录色谱图，见图3。将单味药对照品与样品图谱进行比对，1、4、5、6、7、8、9、10、13 号峰来自于连翘；12 号峰为连翘、贯众和香薷的共有峰；3 号峰来自于香薷；2 号峰和11 号峰为香薷和青蒿的共有峰。

图3 连贯抗病毒颗粒色谱峰归属图

2.4 连贯抗病毒颗粒中3 种成分含量测定

2.4.1 系统适用性试验 精密吸取“2.1”项下制备的咖啡酸储备液1 mL、连翘酯苷A 储备液7 mL、连翘苷储备液2 mL，置25 mL 容量瓶中，用稀乙醇定容，得混合对照品溶液；取编号LG8 的连贯抗病毒颗粒供试品溶液；精密吸取混合对照品稀释液与供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件分别进样，得到混合对照品HPLC 图及连贯抗病毒颗粒HPLC图，见图4。结果显示，咖啡酸、连翘酯苷A 及连翘苷之间分离度良好，理论塔板数均大于5000，分离度均大于1.5。

图4 混合对照品溶液（A）和连贯抗病毒颗粒（B）HPLC 图

2.4.2 线性关系 精密吸取“2.1”项下的咖啡酸储备液1 mL、连翘酯苷A 储备液7 mL、连翘苷储备液2 mL，定容至10 mL，配制成储备液，以稀乙醇稀释配制成不同质量浓度的系列混合对照品溶液，（咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷质量浓度分别为5.19～64.88 μg·mL-1、276.54～3 456.69、54.19～677.38 μg·mL-1）。进样测定，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得到标准曲线，咖啡酸回归方程Y=3.30X×104-1.10×103（r=0.9996），连翘酯苷A 回归方程Y=9.94X×103+1.04×105（r=0.999 5），连翘苷回归方程Y=6.50X×103+7.31×103（r=0.999 6），均与峰面积线性关系良好。

2.4.3 进样精密度试验 取线性曲线中间点的对照品溶液适量，按“2.1”项下条件，连续进样6 次，测得各成分的峰面积，结果咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷峰面积RSD 分别为1.56%、1.51%、2.04%，表明仪器进样精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取编号LG8 连贯抗病毒颗粒供试品溶液，按“2.1”项下条件分别于0、4、8、12、16、20 h 进样测定，记录峰面积，结果咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷峰面积RSD 分别为0.61%，1.53%，2.26%，表明供试品溶液中咖啡酸、连翘酯苷A 及连翘苷在20 h 内稳定。

2.4.5 重复性试验 取编号LG8 连贯抗病毒颗粒供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积并按标准曲线法计算样品含量。结果供试品中咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷平均含量分别为0.3238、16.411 5、2.950 8 mg·g-1（n=6），RSD 分别为1.40%、1.54%、1.83%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取编号LG8 连贯抗病毒颗粒6 份，每份2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，各份分别加入咖啡酸、连翘酯苷A、连翘苷对照品储备液1.25、8.50、2.25 mL，再用稀乙醇补足至25 mL，按“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积并按“2.5.2”项下咖啡酸、连翘酯苷A 及连翘苷的对应标准曲线计算含量及回收率，结果连翘酯苷A、连翘苷、咖啡酸的平均回收率分别为97.55%、98.98%、97.37%、RSD 分别为2.38%、3.27%、1.92%，表明该方法的回收率良好，结果见表2。

表2 回收率试验结果（n=6）

2.4.7 样品含量测定 取10 个批次连贯抗病毒颗粒各2.5 g，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，记录峰面积，通过回归方程计算含量。结果10 批次连贯抗病毒颗粒中咖啡酸含量为0.271 1～0.342 8 mg·g-1，连翘酯苷A 的含量为13.22～18.05 mg·g-1，连翘苷的含量为2.432～3.540 mg·g-1。

3 结论

3.1 色谱方法考察

本实验在建立连贯抗病毒颗粒HPLC 指纹图谱的过程中，考察了乙腈、甲醇及不同种类、浓度的酸对样品的分离效果影响，发现乙腈-0.2%甲酸水作为流动相时，基线平稳，各个峰之间分离效果最好，杂峰少，故选用乙腈-0.2%甲酸水作为最优指纹图谱流动相条件。连贯抗病毒颗粒全波长扫描时，在280 nm 波长下，综合色谱峰的响应值明显，峰型较好，峰信息全面，能够很好展现全方的化学成分特征，最终选择280 nm 波长作为检测波长。

3.2 结果分析

对10 批次连贯抗病毒颗粒进行指纹图谱的聚类分析及主成分分析发现，基本聚为一类，表明10批次的连贯抗病毒颗粒制剂的质量具有良好的一致性。连翘作为方中君药，连翘酯苷A 及连翘苷为其主要成分，连翘酯苷A 可抑制TLR4/NF-κB p65/NLRP3 信号通路改善宫内感染致新生大鼠肺损伤[8]，也能抑制哮喘小鼠的气道炎症反应[9]，连翘苷流感病毒株、人呼吸道合胞病毒、人肠道病毒71 型、人腺病毒3 型及人单纯疱疹病毒均具有一定的抑制作用，且能明显减轻间质性肺炎的肺部病变[10]。因此，本文建立的以连翘酯苷A、连翘苷和咖啡酸为指标成分的连贯抗病毒颗粒的指纹图谱具有代表性。

连贯抗病毒颗粒来源于我院的名医经方，在抗病毒性感冒、肺炎等病毒性感染方面，具有一定的疗效。但我院自制制剂质量标准相对简单，因此，本文采用HPLC 建立了连贯抗病毒颗粒的指纹图谱，提高自制制剂的质量标准，全面反映连贯抗病毒颗粒质量的整体面貌，也为临床使用提供稳定的产品。