金龙消癌丸对非小细胞肺癌细胞体内外增殖凋亡作用的实验研究 *

周 侠 向 培 王晓燕※ 朱为民

（1.江苏省无锡市第二中医医院药械科，江苏 无锡 214121；2.江苏省无锡市第二中医医院肿瘤科，江苏 无锡 214121）

肺癌已成为严重威胁全球人类健康与生命的恶性肿瘤，其发病率和病死率居首位；在中国，肺癌死亡人数占所有癌症死亡人数的近四分之一［1］。其中，非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要类型，占80%～85%［2］。NSCLC临床治疗手段以外科手术为主，术后辅助化学治疗、放射治疗［3］。虽然手术、化学治疗及放射治疗技术的发展使其治疗效果有了很大的提高，但这些手段常伴随严重的不良作用，给患者身心带来严重伤害［4］。此外，中医药的抗癌作用已得到广泛认可，也显示出独特的优势［5，6］。

金龙消癌丸（Jinlong Xiao Ai Pill，JL）为民间验方，由白花蛇、蜈蚣、三七、地龙、壁虎5 味中药组成，用于辅助治疗肺癌、乳腺癌、胃癌等多种恶性肿瘤。项目组前期研究［7］表明，金龙消癌丸联合多西他赛及顺铂治疗晚期NSCLC 患者，总有效率达43.33%，可有效降低血清肿瘤标志物血清基质金属蛋白酶（MMP）-2 和MMP-9 水平，提高治疗效果及生存质量。本研究在此基础上，探讨金龙消癌丸对NSCLC 细胞体内体外增殖凋亡的作用，为中医药防治NSCLC 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞株与实验动物人NSCLC 细胞株A549、NCI-H1299 购自中南大学湘雅医院。30 只SPF 级BALB/c-nu 雄性小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司（合格证编号：SYXK（苏）2017-0052），于SPF 级动物实验中心适应性喂养1 周之后，用于本研究中的实验。所有动物实验均遵照实验动物使用伦理，并经江苏省无锡市第二中医医院伦理委员会批准（批准号：JN.No20201130b0280331［347］）。

1.1.2实验药物金龙消癌丸由无锡市第二中医医院药械科制剂室提供（批号：20191108），由动植物复方组成：白花蛇3 g，蜈蚣50 g，参三七10 g，地龙50 g，壁虎50 g，研磨，制成水丸剂，每粒0.13 g。顺铂注射液购自云南植物药业制药有限公司（国药准字H53021740，批号：20200102）；安替可胶囊购自长春雷允上药业有限公司（国药准字Z10960071，批号：017190901）。CCK-8 试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司（型号：7E522I1）；Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司（货号：C1062M）；C-erB2 单克隆抗体购自Cell signaling technology（货号：4290）。

1.2实验方法

1.2.1药物溶液制备取金龙消癌丸，研钵研碎，完全培养基溶解，40 ℃超声30 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，取上清液，-20 ℃保存备用。安替可胶囊，去除外壳，完全培养基溶解，操作如上。

1.2.2金龙消癌丸对NSCLC细胞体外增殖凋亡作用的研究

1.2.2.1细胞培养及分组取对数生长期的NSCLC 细胞株A549、NCI-H1299，制成5×104个/mL的细胞悬液，每孔200 μL接种于96孔板，贴壁培养24 h。

在研究金龙消癌丸对NSCLC 细胞体外增殖的作用时，将细胞分为8 组，每组6 个平行孔，分别为空白组、金龙消癌丸1～5组、顺铂组和安替可组。分别加入不同浓度的金龙消癌丸溶液（1.25、2.5、5、10、20 mg/mL）以及顺铂注射液（5 μg/mL）、安替可溶液（11 mg/mL）。在研究金龙消癌丸对NSCLC 细胞体外凋亡的作用时，将细胞分为6 组，每组6 个平行孔，分别为空白组、金龙消癌丸1～3组、顺铂组和安替可组。分别加入不同浓度的金龙消癌丸溶液（2.5、5、7.5 mg/mL）以及顺铂注射液（5 μg/mL）、安替可溶液（11 mg/mL）。

1.2.2.2CCK-8法检测细胞增殖情况细胞继续培养24 h 后，更换为含10%CCK-8 溶液的完全培养基，继续培养1～2 h，用酶标仪（厂家：美国分子仪器公司，型号：Moleculr Devices M2e）在450 nm 的波长下检测吸光度，细胞生长抑制率（%）=［1-（OD 值药物组÷OD值对照组）］×100%，直线回归方程计算半数抑制率（IC50）。

1.2.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡情况细胞继续培养24 h后，磷酸缓冲盐溶液（PBS）（自行配制）洗涤2次，消化、离心并收集细胞。用500 μL binding buffer 重悬细胞，再加入10 μL Annexin V－FITC 和5 μL 碘化丙啶（PI）（碧云天生物技术有限公司）并振荡混匀，避光孵育5 min 后，采用流式细胞仪［贝克曼库尔特生物科技（苏州）有限公司，型号：Cytoflex A00-1-1102］检测。

1.2.3金龙消癌丸对NSCLC细胞体内增殖凋亡作用的研究

1.2.3.1造模与分组裸鼠适应性饲养1周后，收集A549细胞，离心去上清液后，用预冷无菌生理盐水洗涤1次后重悬细胞，计数。调整细胞密度为1.33×108个/mL。按1∶1 加入Matrigel 胶，混匀。按1×107个细胞/0.2 mL/鼠接种，在无菌条件下，用1 mL注射器接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。接种后的裸鼠在SPF级动物房中饲养，每隔1 d观察并记录瘤体大小，包括瘤体长短径，称量裸鼠体质量。1 周后，挑选肿瘤生长至100～140 mm3范围的裸鼠备用。

将裸鼠随机分为4 组，分别是模型组、安替可组、金龙消癌丸低剂量组和高剂量组，每组6只。

1.2.3.2给药方案人体与动物的剂量转换公式［8，9］：小鼠灌胃给药剂量（mg/kg）=12.3×成人口服剂量（mg/kg）。金龙消癌丸成人一般剂量3.6 g/d［0.06 g/（kg·d）］，故小鼠的正常给药剂量（mg/kg）=12.3×0.06 g/（kg·d）=0.738 g/（kg·d），并选取正常给药剂量为低剂量组［0.738 g/（kg·d）］，2 倍正常给药剂量为高剂量组［1.476 g/（kg·d）］；安替可胶囊成人一般剂量为1.32 g/d［0.022 g/（kg·d）］，故小鼠的正常给药剂量（mg/kg）=12.3×0.022 g/（kg·d）=0.27 g/（kg·d）。

1.2.4肿瘤测定肿瘤体积测定：给药期间每2 d 用游标卡尺测量移植瘤长径（a）和短径（b），按公式：V=1/2×a×b2计算肿瘤体积，并记录裸鼠体质量变化。

肿瘤重量测定：给药结束后处死小鼠，剥离移植瘤组织，称重，并计算抑瘤率：抑瘤率=（对照组移植瘤组织重量-给药组移植瘤组织重量）/对照组移植瘤组织重量×100%。

1.2.5统计学方法采用GraphPad Prism 8 软件学统计分析，各组数据以（±s）表示，采用多因素方差分析（One way ANOVA）分析多组间差异。以P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1金龙消癌丸对NSCLC细胞体外增殖的作用给药24 h 后，与空白组比较，金龙消癌丸不同浓度给药组对A549 细胞和NCI-H1299 细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，呈剂量依赖性。经计算，对A549 细胞增殖的影响，金龙消癌丸的IC50为4.268 mg/mL，顺铂的IC50为26.820 μg/mL；安替可胶囊的IC50为1.987 mg/mL。对NCI-H1299 细胞增殖的影响，金龙消癌丸的IC50为9.911 mg/mL，顺铂的IC50为2.807 μg/mL，安替可的IC50为10.600 mg/mL。见图1和图2。

图1 金龙消癌丸对A549细胞增殖的影响

图2 金龙消癌丸对NCI-H1299细胞增殖的影响

2.2金龙消癌丸对细胞凋亡的影响给药24 h后，与空白组比较，各给药组细胞凋亡率均显著升高。其中金龙消癌丸不同浓度作用于A549 细胞，浓度7.5 mg/mL 时效果最好，细胞凋亡率达18.25%，呈剂量依赖性。金龙消癌丸不同浓度作用于NCI-1299 细胞，浓度7.5 mg/mL 时效果最好，细胞凋亡率达10.82%，呈剂量依赖性。见图3和图4。

图3 金龙消癌丸诱导A549细胞发生细胞凋亡情况

图4 金龙消癌丸诱导NCI-H1299细胞发生细胞凋亡情况

2.3金龙消癌丸对NSCLC细胞体内抑瘤的作用给药结束后，与模型组比较，金龙消癌丸低剂量组和金龙消癌丸高剂量组、安替可组裸鼠体质量均有所增加，肿瘤体积和重量则明显降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。金龙消癌丸低剂量组和金龙消癌丸高剂量组、安替可组对肿瘤生长抑制率分别为35.30%、40.13%和43.50%。见表1和图5。

表1 4组对裸鼠体质量及其移植瘤的比较 （± s）

表1 4组对裸鼠体质量及其移植瘤的比较 （± s）

注：与模型组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05。

组别模型组安替可组金龙消癌丸低剂量组金龙消癌丸高剂量组鼠数肿瘤生长抑制率/%6666体质量/g 27.4±1.39 27.8±1.15 29.0±1.81 28.9±1.63肿瘤体积/cm3 0.55±1.04 0.36±0.721）0.44±0.832）0.43±0.892）肿瘤重量/g 0.40±0.11 0.23±0.051）0.26±0.032）0.24±0.051）43.50 35.30 40.13

图5 4组裸鼠移植瘤图片

3 讨论

肺癌是目前肿瘤疾病中发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一，临床治疗以抑制癌细胞的生长和转移为主要目标［10］。细胞的增殖凋亡是细胞生命活动的关键特征之一，本研究以NSCLC 细胞在体外和体内的增殖凋亡为观察目标，研讨金龙消癌丸对肺癌的辅助治疗作用。顺铂注射液和安替可胶囊均为临床常用的治疗肺癌等多种肿瘤疾病的西药和中成药，效果确切，机制明晰，作为本研究的对照组用药，能够反映出金龙消癌丸对肿瘤细胞的抑制增殖和促进凋亡作用。

研究结果表明，金龙消癌丸呈剂量依赖性抑制NSCLC 细胞A549 和NCI-H1299 在体外的增殖作用并诱导细胞凋亡。体内裸鼠移植瘤实验也表明，金龙消癌丸能够有效减缓肿瘤生长速度，抑瘤率达40.13%。

肺癌属于中医学“肺萎”“痞癖”“肺积”等范畴，气虚气滞并痰凝血瘀为其主要病因病机。金龙消癌丸由蜈蚣、三七、地龙、白花蛇、壁虎5 味中药组成。方中蜈蚣祛风止痉、通络止痛，在治疗肺癌中药复方配伍中应用广泛［11，12］。蜈蚣提取物体外可抑制肺癌细胞A549的增殖并诱导其凋亡，体内可抑制皮下移植瘤的生长速度，显示出良好的抗肺癌活性［13，14］。三七散瘀止血、消肿定痛，在抗癌治疗中效果显著［15，16］。白花蛇具有搜风、通络、止痛的功效，善于治疗病程较长的顽疾重痹。地龙具有通经活络、止咳平喘、清热等功效，壁虎具有清热解毒、软坚散结、行瘀止痛等功效。五药配伍，共奏抗肿瘤之功效。相信本研究成果将为金龙消癌丸的临床应用提供实验依据，也为中医药治疗肿瘤疾病的临床推广应用奠定基础。