马铃薯GA2ox家族基因响应赤霉素（GA）和低温胁迫表达分析

刘计涛　王梦诗　索海翠　王丽　单建伟　李成晨　安康　李小波

摘要：本研究基于结构域筛选马铃薯（Solanum tuberosum）基因组，获得13个StGA2ox基因家族成员。生物信息学分析结果显示，StGA2ox家族基因分为C19和C20 2个家族，其中C19又分为2个亚族，13个StGA2ox基因不均匀得分布于8条染色体上，其中有5对共线性基因对，7号染色体上有3个基因形成1个串联重复基因簇。此外，StGA2ox启动子区域存在响应低温胁迫、植物激素等多种顺式作用元件。利用实时荧光定量PCR方法分析外源GA₃和低温胁迫处理条件下StGA2ox表达模式，所有StGA2ox基因均能够被外源GA₃诱导表达，其中StGA2ox2、StGA2ox4、StGA2ox8、StGA2ox9和StGA2ox10受低温胁迫诱导表达显著上调，暗示着这5个基因在调节马铃薯低温胁迫耐性中发挥重要功能，可以作为进一步开展马铃薯耐低温研究的候选基因。

关键词：马铃薯；GA2ox基因；生物信息学分析；赤霉素（GA）；低温胁迫

中图分类号：S532文献标识码：A文章编号：1000-4440（2023）05-1110-10

Expression analysis of GA2ox family genes in response to gibberellin （GA） and cold stress in potatoLIU Ji-tao，WANG Meng-shi，SUO Hai-cui，WANG Li，SHAN Jian-wei，LI Cheng-chen，AN Kang，LI Xiao-bo

（Crops Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Crops Genetics and Improvement of Guangdong Province， Guangzhou 510640， China）

Abstract：In this study， 13 StGA2ox family members were obtained by domain screening of the potato genome. Bioinformatics analysis showed that StGA2ox family genes were divided into two families， C19 and C20， and C19 was divided into two subfamilies. The 13 StGA2ox genes which were unevenly distributed on eight chromosomes， including five pairs of collinear gene pairs. And three genes on chromosome 7 formed a tandem repeat gene cluster. In addition， there were several cis-acting elements in the promoter region of StGA2ox in response to cold stress， phytohormones and so on. Real-time PCR was used to analyze the expression pattern of StGA2ox in potato under exogenous GA₃and cold stress treatment. All StGA2ox genes could be induced by exogenous GA₃. Among them， StGA2ox2， StGA2ox4， StGA2ox8， StGA2ox9 and StGA2ox10 were significantly up regulated by cold stress， suggesting that these five genes played an important role in regulating the cold stress tolerance of potato and could be used as candidate genes for further research on cold stress tolerance of potato.

Key words：potato；GA2ox gene;bioinformatic analysis；gibberellin （GA）;cold stress

馬铃薯是中国重要的粮食作物，在保障国家粮食安全上起着重要的作用[1]。但是，随着全球气候的变化，低温胁迫已经成为制约马铃薯产业健康发展的重要因素之一。已经有研究结果表明，许多植物激素如油菜素内酯（BR）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、细胞分裂素（CK）和乙烯（ET）等参与植物对低温等非生物胁迫的响应[2-4]，其中GA在调节植物生长发育与非生物胁迫响应的平衡中起着重要作用[5]。高等植物中活性GA的主要成分是GA₁、GA₃、GA₄和GA₇[6]，其主要功能包括促进细胞分裂和伸长、种子萌发以及植物营养和生殖生长[7-10]。此外，GA还参与植物低温胁迫耐性调节[11-12]，如在拟南芥、番茄、荠菜和棉花中过表达CBF1，促进DELLA蛋白的积累，抑制了GA信号的转导，提升了植物低温胁迫耐性[11，13-15]。拟南芥和水稻GA不敏感突变体gai表现出较强低温胁迫耐性[11-12]。这些结果表明，植物通过抑制GA信号传导提升低温胁迫耐性。

赤霉素2-氧化酶（GA2ox）是调节活性GA降解的主要功能酶，在调节植物低温胁迫耐性中发挥重要功能[11，16-18]。GA2ox能够将活性GA1和GA3转变为失活的GA8和GA34，或促进GA合成前体的降解[16，19]，在拟南芥、水稻、梨和山茶中，过表达GA2ox能够抑制GA的合成，提升植物低温或干旱等非生物胁迫耐性[20-23]。GA2ox家族从属于2OG-Fe（Ⅱ）oxygenase超家族，含有2OG-Fe Ⅱ（PF03171）结构域[24]，GA2ox家族普遍存在于植物中，如在拟南芥、水稻、棉花、二穗短柄草和苜蓿中均被报道[25-29]。基于氨基酸序列的进化树分析将GA2ox基因家族分为3个亚族：C19-Ⅰ，C19-Ⅱ和C20[25，30-31]。研究发现，GA2ox基因家族的扩大源于单子叶植物和双子叶植物基因组的加倍[32]，这导致不同成员存在功能冗余和表达差异的现象，这有利于植物提升低温等非生物胁迫耐性[33-36]。

目前，在玉米、水稻、葡萄、拟南芥、棉花和桃等植物中，已经对GA2ox家族基因进行了系统分析[29，37-41]，但在马铃薯中关于GA2ox家族基因的分布、结构和功能尚未有详细报道。因此，本研究基于马铃薯基因组数据，全面解析StGA2ox基因家族的成员数量、基因特征、染色体上的位置、系统发育树以及编码的蛋白质理化特性、亚细胞定位等，同时对其响应低温胁迫和GA的表达模式进行分析，为进一步探究StGA2ox的功能奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

供试马铃薯品种为费乌瑞它（购于天津市天兴佳业科技有限公司），将种薯切分为25～30 g且包含至少1个芽眼的小块，然后在光照培养箱（达斯卡特 DGZC-P1000B）进行盆栽，基质由草炭土和蛭石2∶1（质量比）混合而成，光照模式为16 h光照，光照度为12 000 lx。

1.2低温胁迫与外源GA处理

低温胁迫处理：选取24株4周大的马铃薯盆栽苗，平均分为6组，每组4个生物学重复，进行低温（-2 ℃）胁迫处理，分别将幼苗置于低温0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后，取顶部向下第3～4片功能叶于液氮中备用。

外源GA处理：选取长势一致的盆栽苗28棵，用100 μmol/L赤霉素（GA₃）喷施叶面1次，每组4个生物学重复，处理后0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h分别取叶片于液氮中备用。

1.3StGA2ox基因家族成员鉴定

从马铃薯参考基因组数据库Spud DB Potato Genatics Resources（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu/index.shtml）下载马铃薯基因组、CDS、StGA2ox基因的染色体位置信息和氨基酸序列。并利用2OG-FeⅡ（PF03171）结构域筛选马铃薯基因组内StGA2ox基因家族成员，并利用SMART确认筛选出的成员编码的蛋白质是否含有2OG-FeⅡ结构域，参考拟南芥、番茄GA2oxs蛋白氨基酸序列进行blastp比对，最终确定马铃薯特异的StGA2ox基因家族成員。

1.4StGA2ox家族基因生物信息学分析

采用在线分析工具WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）分析StGA2ox家族基因编码蛋白质亚细胞定位，ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/）分析StGA2ox家族基因编码蛋白质理化性质。在马铃薯基因组数据库中查找StGA2ox基因的染色体位置信息及对应染色体信息，利用TBtools软件（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）进行StGA2ox基因染色体定位和基因共线性分析。利用Gene Structure Display Server v2.0 （http：//gsds.gao-lab.org/）对基因结构进行分析。进化树采用MEGA7.0（http：//www.megasoftware.net/），以邻接法（Neighbor-Joining method）和Poission模式（Poission Modle）构建。结构域分析采用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme/）在线分析，然后利用TBtools软件作图。

1.5基因表达分析

采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法检测StGA2ox的表达模式。将处理的样本采用Trizol（TaKaRa）法提取马铃薯叶片RNA，分别采用试剂盒GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2 （TSK302M，擎科生物，广州）和2×TSINGKE? Master SYBR Green I qPCR Mix-UDG （Without ROX）（TSE204，擎科生物，广州）进行cDNA合成和qPCR扩增，基因相对表达量计算采用2-△△Ct方法，差异显著分析采用t-test（P＜0.05）进行。

2结果与分析

2.1StGA2ox家族基因鉴定

通过Pfam对2OG-FeII（PF03171）结构域筛选获得候选基因，然后通过参考已报道的拟南芥、水稻、玉米和番茄GA2ox蛋白氨基酸序列blastp比对，最后确定13个编码StGA2ox蛋白的基因。根据这些基因在染色体上的位置分布，分别命名为StGA2ox1～StGA2ox13（表1）。通过蛋白质理化特性分析，发现StGA2ox蛋白的氨基酸数为324～359 aa，相对分子质量和等电点分别为3.624×104～4.188×104和5.61～8.64，不稳定性系数为33.43～55.95，脂溶指数和亲水性指数为72.48～89.97和-0.519～-0.184。通过预测，StGA2oxs蛋白是一类稳定的亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果表明，StGA2ox1、StGA2ox2、StGA2ox4、StGA2ox6、StGA2ox7、StGA2ox10、StGA2ox12和StGA2ox13定位于细胞核，StGA2ox3、StGA2ox5和StGA2ox9定位于细胞质，StGA2ox8和StGA2ox11定位于质体中。

2.2不同物种GA2ox家族基因进化分析

为了进一步解析拟南芥、水稻、玉米、番茄和马铃薯GA2ox家族基因的系统进化关系，利用MAGE 7.0软件对各物种中GA2ox家族基因编码的氨基酸序列进行比对，构建系统进化树（图1）。结果表明，GA2ox基因家族可以分为C19和C20两类，其中C19类GA2oxs基因又分为Ⅰ和Ⅱ两个亚家族，C19-Ⅰ亚族包含成员最多，共计23个，涉及拟南芥、水稻、玉米、番茄和马铃薯5个物种，C20家族包含15个成员，除番茄外其他4个物种均有分布，C19-Ⅱ亚族包含成员最少，包含12个成员（表2）。

马铃薯GA2ox家族基因在3个亚族分类中均有分布，其中StGA2ox4、StGA2ox5、StGA2ox7和StGA2ox12属于C20家族，StGA2ox1、StGA2ox2和StGA2ox6属于C19-Ⅱ亚族，其余StGA2ox基因属于C19-Ⅰ亚族。此外，在C19-Ⅰ亚族中StGA2ox3、StGA2ox8～StGA2ox13与SlGA2ox2、SlGA2ox4、SlGA2ox5亲缘关系较近且处在同一分支，在C19-Ⅱ亚族中StGA2ox1、StGA2ox2、StGA2ox6和SlGA2ox1、SlGA2ox3亲缘关系最近，在同一分支，在C20家族中StGA2ox4、StGA2ox5、StGA2ox12与AtGA2ox8亲缘关系最近，StGA2ox7与AtGA2ox10紧邻。这些结果表明马铃薯GA2ox家族基因与同属茄科的番茄亲缘关系最近。

2.3StGA2ox基因染色体定位与共线性分析

根据StGA2ox基因家族基因组信息，通过TBtools软件进行染色体可视化定位和共线性分析（图2）。13个StGA2ox基因分布在8条染色体上，其中1号、2号和10号染色体上分别含有2个成员，4号、5号、6号和8号染色体上只含有1个成员，7号染色体上包含StGA2ox8、StGA2ox9和StGA2ox10 3个基因，由于其在染色体上的物理距离小于100 kb，且进化树分析其同源性较高，推断其为一个串联的基因簇。进一步分析马铃薯StGA2ox基因家族的扩张模式和基因复制事件，结果发现，13个StGA2ox基因之间存在5对共线性基因对，表明马铃薯StGA2ox基因家族在进化过程中存在基因复制现象，导致基因家族的多样性。

2.4StGA2ox家族基因结构和Motif分析

对马铃薯13个StGA2ox基因家族成员进行系统基因结构和Motif分析（图3），结果表明，除去StGA2ox4包含3个内含子4个外显子外，其余所有StGA2ox均包含2个内含子3个外显子，其中StGA2ox1不包含非编码区。进一步分析StGA2ox蛋白氨基酸序列，发现所有基因均包含motif 1和motif 3，C20家族基因不包含motif 4，motif 10主要存在于C19-Ⅱ亚族基因中，而motif 5主要存在于C19-Ⅰ亚族基因中。

2.5马铃薯StGA2ox基因启动子cis-element分析

为进一步解析StGA2ox家族基因在转录水平上的调节机制，根据马铃薯基因组获得1.5 kb启动子序列，并通过PLACE网站进行分析。结果（图4）表明，StGA2ox基因启动子区域富含响应植物激素的顺式作用元件，包括脱落酸（ABA）响应元件ABRE、赤霉素（GA）响应元件GARE、茉莉酸（JA）响应元件JARE、乙烯（ET）响应元件ERE、小杨酸（SA）响应元件SARE和生长素（Auxin）响应元件ARE；还包含生长发育相关顺式作用元件I-box、LAMP和G-box等，以及MYC、LTR和W-box等逆境胁迫相关顺式作用元件。其中，除StGA2ox6和StGA2ox8外，所有StGA2ox启动子上都含有GA响应顺式作用元件GARE，StGA2ox1～StGA2ox4和StGA2ox9～StGA2ox12都含有低温胁迫响应顺式作用元件LTR，这一结果暗示着StGA2ox家族基因在响应GA和低温胁迫上可能发挥重要功能，但是家族成员之间的功能存在差异。

2.6StGA2ox响应GA处理和低温胁迫的表达模式分析为了进一步解析StGA2ox家族基因响应GA和低温胁迫的表达模式，通过RT-PCR方法分析低温胁迫24 h和外源GA₃处理后48 h马铃薯叶片中13个StGA2ox基因的表达。在外源GA₃处理条件下，StGA2ox1、StGA2ox2和StGA2ox6基因的表达在处理后3 h显著上调，随后又降低，在GA₃处理3 h后分别为对照的6.56倍、41.68倍和2.36倍；StGA2ox3和StGA2ox8～StGA2ox13基因在GA₃处理后0～6 h表达上调，12～48 h又逐渐降低，最终在48 h恢复至0 h的水平，在处理后6 h表达量是对照的5.89～27.29倍，其中StGA2ox12表达量变化最小，StGA2ox13表达量变化最大；StGA2ox4和StGA2ox5基因在GA₃处理后0～12 h表达量上调，12～48 h表达量逐渐降低，在处理后12 h表达量分别为对照的73.19倍和16.2倍；另外，StGA2ox7的表达量仅在GA₃处理后6 h迅速上调至对照的20.85倍，随后迅速降至对照的90%（图5）。

在低溫胁迫条件下，StGA2ox1、StGA2ox3、StGA2ox11和StGA2ox12基因的表达被抑制，低温胁迫6 h，StGA2ox1、StGA2ox3、StGA2ox11表达量最低，下调50%、61%、78%；而StGA2ox2、StGA2ox4和StGA2ox8～StGA2ox10基因的表达量受低温胁胁迫诱导上调，并且在低温胁迫24 h后，分别上调了8.68倍、20.28倍、6.84倍、14.62倍和6.44倍；StGA2ox6的表达量在低温胁迫1 h后达到对照的2.29倍，随后又降低至0 h的水平；StGA2ox7的表达量在0～12 h差异不显著，仅在24 h下调63%（图6）。综上所述，StGA2ox家族基因在响应GA3和低温胁迫中呈现不同的表达模式，为充分理解马铃薯StGA2ox家族基因的功能提供了依据。

3討论

马铃薯是重要的粮菜兼用型经济作物，具有产量高、效益好和营养丰富等特点［42-45］。低温寒害是影响马铃薯产量的关键因素之一，中国几乎所有马铃薯生态种植区都会受其影响。GA是调节植物生长发育重要的植物激素，广泛参与植物对低温胁迫等非生物胁迫的响应[17]。GA2-oxidases是调节植物活性GA钝化的关键酶之一，能够降低植物活性GA含量，负调控植物的生长发育，参与低温、干旱等非生物胁迫响应[41]。GA2ox家族基因编码的蛋白质包含2OG-FeⅡ（PF03171）结构域，从属于20G-Fe（Ⅱ） oxygenase基因超家族[24]。目前，许多物种中已经进行了全基因组家族分析，如拟南芥中鉴定出10个AtGA2ox基因，荔枝中鉴定出9个LcGA2ox基因[28，46]，水稻中包含10个成员[25]，玉米中鉴定到分布于7个染色体上的13个ZmGA2ox基因[40]。

在本研究中，基于马铃薯基因组数据共获得13个StGA2ox基因，进化树分析结果表明，StGA2ox基因家族分为2个家族，其中C19家族又分为C19-Ⅰ亚族和C19-Ⅱ亚族，这与其他作物中的研究结果一致[39]。分析基因家族成员的结构和保守motif序列，能够为更全面解释基因家族进化和功能分化提供重要依据[47]，研究发现，StGA2ox不同亚家族之间基因结构和保守motif序列存在显著差异，在玉米、水稻和荔枝等作物中也有相同的结果[25，28，40]。为了进一步明确马铃薯StGA2ox基因家族的基因组信息，通过染色体定位发现这13个StGA2ox基因主要分布于8条染色体上，并在7号染色体上存在一个串联基因簇。此外，共线性分析结果表明，StGA2ox存在5对共线性基因对，表明其在进化中存在基因复制现象，这些结果可为深入理解StGA2ox基因家族的进化过程提供参考。

植物通过合成或钝化维持内源GA相对平衡，保障植物正常的生长发育进程[16]，GA2ox基因能够负反馈调节活性GA的动态平衡，促进植物的正常生长[17]。研究结果表明，所有的StGA2ox基因都能够被外源GA诱导表达，且表现为先升高后降低的趋势，但是不同家族基因存在显著差异，如C19-Ⅱ亚族基因StGA2ox1、StGA2ox2、StGA2ox6的表达对外源GA处理响应最早，其次为C19-Ⅰ亚族基因StGA2ox3、StGA2ox11和StGA2ox13，最晚响应的是C20家族基因StGA2ox4和StGA2ox5。此外，GA2ox作为调节植物活性GA的重要基因，广泛参与了激素信号传导和非生物胁迫响应[41]。例如，低温胁迫能够促进OsGA2ox6和OsGA2ox7基因表达，使活性GA钝化[48]，ZmGA2ox6和ZmGA2ox10能够被低温胁迫和盐胁迫诱导表达[41]。研究发现StGA2ox2、StGA2ox4、StGA2ox8、StGA2ox9和StGA2ox10受低温胁迫诱导显著上调表达，暗示这5个基因在调节马铃薯低温胁迫响应中发挥重要作用。基因的表达受上游转录因子调控，顺式作用元件是影响基因表达的重要因素[49]。通过启动子分析发现响应GA的GARE顺式作用元件存在于所有StGA2ox启动子上，并且在StGA2ox1～StGA2ox4和StGA2ox9～StGA2ox12的启动子上存在响应低温胁迫的LTR顺式作用元件，这与玉米、水稻和高粱等作物中的研究结果一致[41]。综上所述，本研究结果能够为解析马铃薯StGA2ox基因通过负反馈调节活性GA动态平衡，参与调节低温胁迫响应的作用机理提供依据，有助于马铃薯寒害预防理论的完善。

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