马属动物富血小板血浆制备方法

彭 聪,李 靖,汤小朋,朱怡平

(中国农业大学动物医学院,北京 100193)

富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)于20世纪70年代人类医学领域提出,常用于整形外科、小儿外科、心脏外科、妇科、眼科等[1]。在兽医学上PRP最初应用于马运动医学领域,用于治疗马运动疾病如韧带、肌腱损伤等,后来也逐渐外用于治疗马关节炎、促进创伤愈合等,近年来还有关于宫内灌注PRP治疗马属动物子宫内膜炎的报道[2]。

PRP促进损伤愈合的机制比较复杂,在体外研究中PRP能促进生物活性因子的合成和代谢,如促进生长因子(growth factor,GF)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、抗炎因子、白介素-1(interleukin-1,IL-1)受体拮抗剂的释放[3],控制炎性反应。在体内研究中,PRP可提高损伤部位修复效率和修复质量,如在肌腱损伤修复中,PRP治疗后可使组织生物化学特性改善,胶原蛋白、糖胺聚糖等含量增加,加速损伤修复[4]。在骨关节疾病和骨折愈合相关研究中,PRP治疗组马匹表现出良好临床恢复效果[5-6],这说明PRP可能是一种有效的骨或关节损伤治疗手段。

马PRP最佳治疗浓度尚无定论,人医中PRP推荐血小板浓度为全血的2～6倍[7]。在马损伤修复应用中,PRP最佳治疗浓度、细胞组成和体积取决于患马生理状况、疾病类型和损伤部位等因素,这为PRP制备提出了更高要求。当用于治疗马肌腱损伤或关节疾病时,大约需要向损伤部位或关节内注射2～5 mL的PRP;当采用子宫灌洗PRP治疗子宫内膜炎时,需要10～60 mL才能覆盖整个子宫内膜表面[8]。尽管目前已有大量马属动物PRP的相关研究,但对治疗不同损伤组织的最佳PRP治疗浓度和细胞组成尚未达成共识。

在欧美等发达国家和地区,PRP已成为马属动物运动损伤治疗的一种常用手段。美国72.5%的受访马兽医曾使用过PRP治疗马关节疾病[9]。我国由于对PRP原理及其制备方法缺乏报道,该疗法尚未得到广泛应用。本文根据现有文献回顾了马属动物PRP的几种制备方法及影响因素,旨在为探索马属动物PRP最佳制备方案提供一定参考。

1 PRP制备方法

1.1 商品化制备方法

商品化制备方法是指使用全自动细胞分离器或商品化试剂盒制备PRP,均是基于离心技术辅以传感器、光吸收等配件实现PRP的自动分离,最初是根据人类血液特性设计的参数和程序,现也用于马属动物PRP的制备。但马属动物和人类血液学特性不尽相同,其制备效率及对PRP活性影响还需进一步探究。近十年内,大量研究使用试剂盒制备马PRP并进行疾病治疗效果评估,但尚无研究采用全自动分离系统制备马PRP[2]。

相较于全自动分离系统,商品化试剂盒更为经济和实用。PRP制备试剂盒根据血小板富集指数(PRP血小板浓度与全血中血小板浓度比值)可分为高富集试剂盒(5～9倍)和低富集试剂盒(2.5～3倍)。高富集试剂盒包括Biomet GPS Ⅱ、Biomet GPS Ⅲ、Harvest smartPRep 2 APC+、Arterio cyte-medtronic magellan等,低富集试剂盒包括Arthrex ACP、Cascade PPR therapy、PRGF by boitech institute vitoria等[1]。还有一种马专用且无需离心的试剂盒——E-PETTM依靠重力富集血小板。E-PET在富集血小板、PDGF、TGF-β1方面效果更好[10]。商品化PRP制备方法具有污染小、自动化等优势,但昂贵的仪器或试剂盒使其在临床应用中受到限制。

1.2 实验室制备方法

实验室制备方法具有成本低、PRP组成和浓度可控等特点,是商品化制备法的有效替代。其基本原理是利用离心技术将血液中的不同成分进行分离。在离心操作之前,需要采集马属动物全血。一般通过颈静脉穿刺并采用预置有抗凝剂的标准试管或血袋收集全血,采血量根据用途不同而有所差异。制备方法根据离心方案不同,可分为单次分离法、双次离心法、白膜法、悬浮法、冻干法等。

1.2.1 单次分离法 实施单次离心法时,采血后需在室温下尽快进行离心。得到上层血浆的顶部为贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP),上层血浆其余部分为PRP。单次离心法具有耗时短、操作简单、细菌污染少等优势,但由于仅离心一次,可能存在富集指数低、血细胞污染严重等缺点[8]。目前尚无公认的最佳单次离心方案,一般在制定离心方案时,转速和持续时间成负相关。不同研究结果表明,以120 r/min 10 min和1 200 r/min 3 min处理全血得到的PRP中血小板浓度接近[8-11]。

1.2.2 双次离心法 采血后第1次离心用较小离心力处理全血,将含有血小板的上清血浆转移到无菌离心管中,再以更大离心力得到血小板浓缩物。血小板浓缩物下1/3为PRP,用移液枪除去上2/3的PPP即可得到PRP[12]。该方法具有血小板回收率高、受白细胞(white blood cell,WBC)和红细胞(red blood cell,RBC)污染较少等优势,但需人工转移血浆,会增加潜在细菌污染风险,因此需注意无菌操作。此外,第2次离心时离心参数设置也是获得高质量PRP的关键所在。有研究比较了双次离心法和单次离心法,认为两种方法均可富集血小板(1.8～5.6倍)并减少WBC和RBC残留,但前者血小板浓度是后者2.2倍[8]。

1.2.3 白膜法 全血在离心前可储存于20℃～24℃。离心时采用高转速(通常>1 000 r/min)将全血分为3层:底层是RBC,中间层(即白膜)是WBC和血小板,顶层是PPP,移除顶层上清液,将白膜转移到无菌离心管中,使用低速离心或过滤器分离WBC后即可得到PRP[13]。白膜法和双次离心法在离心顺序和离心力方面存在差异。在保护血小板活性方面,白膜法离心时RBC可为血小板提供生理缓冲,减少血小板的早期激活,得到的PRP可能活性更佳[14]。有证据表明,白膜法制备的PRP中血细胞污染风险更高,采用白膜法从犬血中制备的PRP与使用双次离心法相比含有更多的WBC和RBC[15],但目前尚无这两种方法制备马属动物PRP的对比研究。

1.2.4 悬浮法 首先用预置有抗凝剂的注射器采集并保存全血,将注射器包裹在铝箔中直立放置4 h,随后将导管连接在注射器上,把注射器直立放置并以稳定的力推动注射器活塞,得到PPP和PRP[12]。在本方法中,PPP和PRP无肉眼可见的分界线,因此需要人为判断富血小板血浆分界位置,一般认为上1/6为PPP[8]。悬浮法仅依靠重力来分离PRP,其主要优势是操作方便、设备简单,但耗时长、极易受WBC和RBC污染。WBC和RBC在储存过程中会产生代谢产物,降低血小板活性,因此悬浮法制备的PRP不适合长时间保存[8]。

1.2.5 冻干法 冻干法是在已制备得到的PRP基础上,将其放入-80℃冷冻,再放入冻干机干燥升华,具体参数视仪器而定,最终得到固体粉末状PRP。冻干PRP目前常用于促进伤口愈合和治疗关节疾病[16]。液态PRP需要现场制备,否则全血中血小板活性会降低。液态PRP难以长时间保存,而冻干PRP具有易于保存和便于使用的优势,为预先制备、长期储存、随时使用提供了有利条件。同时,制备异体PRP也依赖于冻干技术。有证据表明,冷冻干燥不仅不会降低PRP中生长因子活性[17],还能破坏血小板膜表面免疫球蛋白和抗原结构,减少免疫排异反应[18]。另外,异体PRP可为血小板功能异常或缺乏的患病马匹提供可行的PRP治疗方案。

2 PRP制备的影响因素

在制备或储备PRP过程中,若操作不当会造成血小板不可逆性激活,从而失去活性。WBC、RBC、活化凝血因子、细胞碎片和蛋白水解酶污染以及不当离心都可能导致PRP活性及浓度下降,因此如何选择合适制备方案和参数显得尤为重要。在PRP制备过程中,影响血小板活性和浓度的因素众多,包括离心参数、抗凝剂选择、供血马匹生理状况、无菌操作技术等。

2.1 离心方案

合理的离心方案是在实验室制备中能否获得合格血小板浓度的关键,大多数PRP制备过程涉及两次离心用于分离和浓缩血小板,其主要影响因素是转速和离心时间。一般来说,转速无论大小,都能获得理想的血小板浓度,当转速较大时,离心时间应相应缩短;当转速较小时,离心时间需要适当延长。但转速过大会导致血小板破裂、活性下降[19]。离心次数也会影响血小板、WBC和RBC含量。第2次离心可以达到再次富集血小板的目的,提高血小板含量[8],还能减少PRP中WBC、RBC残留[20],但再次离心的过程会增加来自操作人员、环境的污染风险。最常用制备方案仍为双次离心法,根据目前已有制备方案,第1次低速离心的转速通常为120～400 r/min,第2次离心的转速通常为300～1 000 r/min,一般来说第2次转速更高,离心时间可适当延长[8-11]。截至目前,在马属动物PRP相关研究中对最佳离心方案未达成一致,尽管有较多研究涉及PRP制备,但未有研究系统性比较不同离心方案的优劣,仍需更多研究进一步探索。

2.2 抗凝剂

为得到液态PRP,采集血液时需在全血中加入抗凝剂。不建议使用乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)制备PRP,因其可能会损伤血小板细胞膜并抑制血小板脱颗粒,导致活力下降。目前已报道可用于马属动物PRP制备的抗凝剂有柠檬酸钠(sodium citrate,SC)、枸橼酸、腺嘌呤、枸橼酸钠、磷酸二氢钠和葡萄糖溶液(CPD-A)、柠檬酸葡萄糖溶液A溶液和B溶液(ACD-A、ACD-B)[2]。ACD-A能将血小板pH保持在最佳值7.2左右,且柠檬酸盐能与钙结合,防止凝血级联反应[22],ACD-A与全血比例为1∶7～1∶9。与ACD作用效果相似,CPD-A与全血的比例为1∶7,但其维持代谢的成分较少,在维持血小板活力方面较弱[22]。ACD-A是商品化试剂盒中最常用抗凝剂,含有柠檬酸盐的抗凝剂会降低PRP的血管再生作用且对局部组织有毒性作用[23],说明SC、ACD-A、ACD-B不适合用于PRP制备,CPD-A可能是用于制备PRP的较优选择。

2.3 无菌操作技术

细菌污染不仅会产生大量细菌代谢物质导致血小板活性下降,还可能会引起治疗部位感染,因此在制备过程中尤其在使用非商品化制备方法时,需严格遵守无菌操作原则。PRP制备过程中细菌污染主要来自马属动物静脉穿刺部位皮肤表面、采血人员手部、上呼吸道以及环境。为了防止PRP产品被细菌污染,建议操作人员进行适当手部消毒并佩戴无菌外科手套,对静脉穿刺部位可采用聚维酮碘或碘酊与酒精的组合进行消毒。若条件允许,最好在清洁无气流环境下或超净工作台内进行制备[2]。

2.4 供血马生理状况

供血马品种、性别、年龄均会影响PRP中血小板浓度。雌性5岁以下马匹血液制得的PRP中血小板含量更高,不同品种马采用相同制备方案得到的PRP中血小板浓度也不同,这可能与不同品种马血小板及WBC大小和重量不同有关[24]。

3 展望

尽管国外诸多文献阐述了马属动物PRP制备方案,但国内依然缺乏关于马属动物PRP组成、激活、活性测定和应用方法等信息的介绍,极大限制了马属动物PRP制备体系建立和标准化研究。除此之外,特定浓度或组成的马属动物PRP在不同疾病或组织损伤中治疗效果也亟待研究,以便建立不同疾病的PRP最佳制备方法及治疗方案。同时,马属动物PRP研究存在较大异质性,如全血中血小板浓度、全血体积、疾病严重情况等难以统一,影响对PRP质量及治疗效果的评估。马属动物PRP制备方案仍有诸多因素有待统一,制备方案的标准化不仅有利于促进PRP在马属动物临床疾病治疗中的应用,也有利于提高PRP相关研究结论的可靠性与一致性。