云南昭通某屠宰场猪源沙门氏菌的分离鉴定及耐药表型分析

解水梅，宋春莲，武 鑫，张 莹，林钧艺，张王芝，耿志诚，袁 红，李永荟，潘 琼，舒相华

（云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201）

沙门氏菌为一种人畜共患食源性致病菌，广泛存在于自然环境中，可感染鸡、猪、牛和人等多种动物。人感染的主要症状是发热、腹泻，严重者甚至引发菌血症。研究表明22.2%的食源性疾病是由沙门氏菌引起的，且引起沙门氏菌中毒的食品中90%以上是动物性产品。根据欧洲食品安全局和美国食品药品监督管理局统计显示，欧洲每年有超过10 万例的人患沙门氏菌病，在美国每年的沙门氏菌感染已经增加到1200 万人，引起大约1.9 万人住院，约450 人死亡。在我国，据2021 年食源性疾病暴发监测结果显示，沙门氏菌引起的食品安全事件数和发病人数分别占 29.76%（225/756） 和 27.55%（3192/11585），位居细菌性食物中毒的首位。可见，沙门氏菌的广泛传播给国内外的食品安全和人类健康带来了巨大的威胁。

食品安全关系我国基本民生，猪源性食品是食品的重要组成部分，2019 年我国猪肉消费量为4486 万t，全球猪肉消费量达到1.009 亿t，因此，保证生猪生产供应及副产品安全极其重要。动物在屠宰过程中易受到环境源性污染或胴体本身携带致病菌，孙向华等对2013～2016 年北京10 家生猪屠宰场猪肉产品进行食源性致病菌污染状况调查发现肠道沙门氏菌、单增李斯特氏菌和空肠弯曲菌的污染率分别为0.50%、5.33%、2.67%和1.33%；刘鲜鲜等对山东部分生猪屠宰场屠宰环节污染沙门氏菌状况调查发现污染率为19.96%；周政对湘潭县3个生猪屠宰场的猪肉及环境样品进行沙门氏菌污染情况调查发现沙门氏菌污染率为10.00%。若携带人畜共患致病菌的动物在屠宰时未被检出或动物产品加工过程中受致病菌污染，都有可能使致病菌被食用进入机体，引起食源性疾病。

随着抗生素在畜牧业的不合理使用，沙门氏菌也表现出越来越复杂的耐药性。研究表明，沙门氏菌属的多重耐药率在20 世纪90 年代为20%～30%，到21 世纪初期已达70%。因此对屠宰猪的沙门氏菌进行监测及了解其耐药性非常有必要。

为了解昭通某屠宰场猪胴体的沙门氏菌带菌情况，本实验随机采集猪胴体样品58 份，进行细菌分离、生理生化鉴定、革兰氏染色镜检、基因型鉴定及药敏试验，综合沙门氏菌的检出情况对该病的防控提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病 料 样品来自云南昭通某屠宰场58 头猪的胴体拭子。

1.1.2 试验试剂及仪器 改良半固体Rappaport-Vassiliadis（MRSV）培养基（0230252）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）培养基（1101585）、三糖铁（TSI） 培养基（1097391）、Motility-indole-lysine medium（MIL）培养基（32131401），靛基质试剂（6108269）、改良缓冲蛋白胨水（BPW） 培养基（1091781）、LB 肉汤（1096311）均来自广东环凯生物科技有限公司，Hektoen Enteric （HE） 培养基（HB4093-8）购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，细菌基因组提取试剂盒（9763，昆明丰科生物科技有限公司），革兰氏染色试剂盒（20210103，北京索莱宝科技有限公司），药敏片（20200830，杭州滨河微生物试剂有限公司）。

PCR 扩增仪（846-X-070-30，德国耶拿公司），凝胶成像分析仪器（WD-9413B，北京六一生物科技有限公司），生化培养箱（SPX-150，上海申贤恒温设备厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 用无菌棉拭子擦拭屠宰后猪的体表皮肤、腹股沟等位置，将棉拭子放入装有3mL BPW（加1%琼脂粉）的离心管中保存，送至实验室立即分离培养。

1.2.2 细菌分离培养 将拭子用BPW 培养基增菌培养后，接种环沾取菌液用三点涂布法接种于MRSV 培养基，41.5±1 ℃培养24 h 后观察是否发生迁移，挑取迁移菌落接种于XLD 培养基，36±1℃培养18～24 h 后观察菌落形态。

1.2.3 生理生化鉴定 挑取XLD 上的4 个黑色单菌落分别穿刺接种斜面TSI 和MIL 培养基，36±1℃培养18～24 h，观察TSI 培养基颜色，以及观察MIL 培养基是否有白色环，滴入2 滴靛基质试剂，观察是否出现品红色，出现则为吲哚阳性。

1.2.4 革兰氏染色镜检 将TSI 上的细菌接种至LB 琼脂培养基，37 ℃培养24 h 后进行革兰氏染色镜检，具体操作为：涂片固定，结晶紫初染1 min，碘液媒染1 min，乙醇脱色30 s，番红复染1 min，光学显微镜进行观察细菌形态特征。

1.2.5 16S rRNA 基因鉴定 挑取LB 琼脂培养基上的单菌落用LB 肉汤活化12 h 后吸取1mL 菌液，按照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书提取细菌的DNA。采用细菌通用引物16s 515F（AAGGAGGTGATCCRGCC）和16s 1542R（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）进行PCR 扩增细菌DNA，PCR 扩增体系为25 μL：Taq (mix) 11.2 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL。扩增DNA 目的片段大小约为1027 bp。扩增程序为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，33 个循环，72℃延伸5 min。PCR 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统上观察拍照。将扩增产物送至上海生工生物科技有限公司测序，用Seqmen 对测序数据进行拼接，拼接结果输入NCBI 官网，与Genbank 数据库进行BLAST 同源性比对。

1.2.6 药敏试验 用Kirby-Bauer 法进行药敏实验，具体操作为移液枪吸收200 μL 细菌菌液，用涂布棒将菌液涂均匀后用镊子夹住氨苄西林（AMP，10 μg/片）、氯霉素（CHL，30 μg/片）、链霉素（STR，10 μg/片）、环丙沙星（CIP，5 μg/片）、头孢曲松（CRO，30 μg/片）、复方新诺明（SXT，1.25 μg/片）和多粘菌素B（CT，300 μg/片）的药敏片边缘，并按照一定的顺序将其贴在相应区域的中间，轻轻按压以固定。将其置于恒温箱培养18～24 h，然后采用电子游标卡尺测量其抑菌圈直径。不同药物的判定标准参照临床与实验室标准化研究所CLSI（2013）推荐的标准。

2 结果与分析

2.1 细菌的生长特性观察 由图1 可知，分离菌株在MRSV 培养基上沿穿刺孔向周边迁移，迁移区域呈灰白色；在XLD 培养基上长出无色透明，有黑色中心的菌落；染色后镜检可见细菌为红色的短杆状的革兰氏阴性菌。

图1 分离菌在培养基上的生长情况和革兰氏染色结果

2.2 生理生化鉴定结果 分离菌在TSI 培养基斜面和底层均为黑色，产气，产硫化氢，MIL 培养基有白色环，滴加靛基质试剂变为品红色，见图2。

图2 TSI 培养基（左）和MIL 培养基（右）

2.3 16S rRNA 基因鉴定结果 电泳检测的目标条带大小为1027 bp，与预期片段大小一致（见图3）。将测序结果输入Genbank 用Blastbp 软件进行同源性比较，发现相似度性最高的是沙门氏菌，且相似度均高于99.00%。本次试验共分离出13 株沙门氏菌，分离率为22.41%。

图3 细菌PCR 扩增结果

2.4 药敏试验结果 由表1 和表2 可知，6 株沙门氏菌对多粘菌素B 敏感，4 株对头孢曲松敏感，3 株对氨苄西林、环丙沙星和复方新诺明敏感，其余均为中度敏感和耐药。分离的12 株沙门氏菌共存在10 种耐药表型，其中以CHL-AMP- CIP- SXT，CHL- AMP- CRO - STR- SXT 和CHL- AMPCRO-STR- CIP-SXT（2/13，15.38%）3 种耐药表型为主。且呈现多重耐药（3 重～6 重），其中4 和6 重所占的比例最大，达到30.77%，其次是3 重和5 重，占15.38%。这些结果说明沙门氏菌耐药性比较严重。

表1 药敏试验结果

表2 13 株沙门氏菌的耐药表型

3 讨 论

由于抗生素在畜牧业的不合理使用，沙门氏菌也表现出越来越复杂的耐药性。药敏实验结果表明，12 株沙门氏菌（20.69%）呈现3 重～6 重耐药，4和6 重所占的比例最大（30.77%），提示送往该屠宰场的猪可能造成多重耐药的传播。

本研究表明沙门氏菌的分离量为22.41%，沙门氏菌分离使用的猪胴体拭子样品是在生猪劈半后采集的，属于屠宰处理后期，被检产品即将进入消费市场。在猪胴体上检出这种食源性致病菌，若后期加工处理不足以充分杀灭致病菌，将会对消费者的健康造成巨大威胁，同时也影响社会的稳定发展。

屠宰猪存在沙门氏菌的原因可能是屠宰环节污染严重，彭通通等研究表明屠宰前污染沙门氏菌的重点环节是屠宰地面（53.3%）和传送带（33.3%），屠宰时重点污染环节是劈半（55.0%） 和修饰（45.0%）。王鑫盛等研究表明沙门氏菌在待宰、麻电环节中的检出率（分别为37.4%、26.5%）明显高于体表拭子样本（脱毛20.5%、劈半17.1%、冷却14.4%），而在环境样品中，下白脏地面阳性率最高（15.0%），冷却间地面最低为5.0%。说明猪感染致病菌可能是因为屠宰环节互相污染。屠宰场作为定点屠宰单位，出现沙门氏菌，不仅威胁到人的健康还可能会通过运输、人员接触扩散至各个养殖场。

因此屠宰场首先应当做好防疫检疫工作，建立完善的防疫体系，能从根本上减少致病菌对动物健康所产生的危害；其次屠宰场在接收生猪前严格按照我国《生猪屠宰检疫规程》对送宰生猪进行检疫，尽量避免带有致病菌的生猪进入屠宰场；最后屠宰前对屠宰流水线设备进行全面消毒，参与屠宰的工作人员穿防护服进行操作，以减少食源性致病菌在屠宰场和人畜间的传播。

4 结 论

本实验从云南昭通某屠宰场屠宰胴体分离出13 株沙门氏菌，13 株沙门氏菌均呈现多重耐药，可能会对食品安全和人类健康造成潜在威胁。