嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲致病力的时间效应及对血淋巴的影响

吕朝军, 张楚毓, 钟宝珠, 赵建超, 陈 拓

中国热带农业科学院椰子研究所,海南 文昌 571339

红棕象甲Rhynchophorusferrugineus(Oliv.)是棕榈科植物的重要害虫,对椰子CocosnuciferaL. (Chakravarthyetal.,2014; Lizanneetal.2016)、油棕ElaeisguineensisJacq. (Nazmietal.,2020)、椰枣PhoenixdactyliferaL.(Manzooretal.,2022)等造成了极为严重的损失。随着人们对食品健康、生态保护的要求越来越高,生物防治作为重要的防控手段日益受到重视。红棕象甲的生防因子包括绿僵菌(Ahmedetal.,2022)、白僵菌(Ahmed &Freed,2021)、细菌(Almasoudietal.,2022; Celietal.,2022)、昆虫病原线虫(Aqsa,2020; Wanetal.,2021; Yasinetal.,2021)等。目前,昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes, EPNs)在农业害虫防治中越来越表现出其优越性,由于其喜欢潮湿隐蔽的环境,常被用于防治钻蛀害虫和土壤害虫(刘奇志等,2002)。研究发现,在沙特将EPNs施用到土壤中后,可导致60%和46%的红棕象甲幼虫和成虫死亡(Saleh &Alheji,2003);在实验室条件下处理8 d后,嗜菌异小杆线虫HeterorhabditisbacteriophoraPoinar对红棕象甲致死率达到86.9%(Manzooretal.,2017);EPNs功效评估结果显示,在阿联酋的椰枣园本土分离的异小杆线虫能在短时间内成功杀死红棕象甲的幼虫、成虫和茧,椰枣地的RPW种群也成功减少(Elawadetal.,2007)。由于其对昆虫宿主的高致病性(Gozeletal.,2015),2种常见的EPNs被用作害虫综合治理中的生物控制剂(Griffin,2012)。钟宝珠等(2020a,2020b)研究表明,嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫具有一定的防控潜力,但其对红棕象甲的血淋巴等免疫系统的影响还未可知。因此,本试验系统研究了嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲各虫态的动态毒力水平,及对幼虫血淋巴总量、血淋巴酯酶活性及血淋巴蛋白含量的影响,以期为揭示嗜菌异小杆线虫H06品系侵染红棕象甲的作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

嗜菌异小杆线虫H06品系及红棕象甲各虫态均由中国热带农业科学院椰子研究所生物防治实验室自繁自养。其中,嗜菌异小杆线虫H06品系以大蜡螟Galleriamellonella(L.)幼虫为寄主进行扩繁,采用White (1927)方法收集3龄感染期线虫(infective juveniles, IJs),使用前用蒸馏水稀释至系列浓度备用;红棕象甲采用半人工饲料(马子龙等,2012)进行饲养。

试虫繁育及毒力试验均在温度(26±1) ℃、湿度(70±5)%的室内开展。

1.2 试验方法

1.2.1 嗜菌异小杆线虫对红棕象甲不同虫态致病力的时间效应 8龄幼虫致病力测定:用移液枪吸取1 mL线虫溶液,均匀滴加在红棕象甲背部,将试虫转移至养虫盒(35 cm×24 cm×11 cm)中,养虫盒内预先放置2层甘蔗段作为试虫饲料。每处理30头,重复3次,处理后逐日统计死亡率,连续统计5 d。以昆虫针轻触虫体,完全不动者为死亡。以蒸馏水处理为对照。

卵致病力测定:将卵置于养虫杯(φ4 cm×3 cm)中,杯底覆盖滤纸,用移液枪滴加1 mL不同浓度线虫液至滤纸上。处理后逐日统计卵死亡率,连续统计5 d。每处理30粒,重复3次,以卵变红色或黑色为死亡。以蒸馏水处理为对照。

蛹致病力测定:将红棕象甲蛹单独置于养虫杯(φ4 cm×3 cm)中,杯底覆盖滤纸,用移液枪滴加1 mL不同浓度线虫液至滤纸上。处理后逐日统计蛹死亡率,连续统计7 d。每处理30头,重复3次,以毛笔轻触蛹体,蛹不动者为死亡。以蒸馏水处理为对照。

成虫致病力测定:将红棕象甲成虫单独置于养虫杯(φ4 cm×3 cm)中,杯内添加甘蔗块作为试虫饲料,杯底覆盖滤纸,用移液枪滴加1 mL不同浓度线虫液至滤纸上。处理后逐日统计成虫死亡率,连续统计7 d。每处理30头,重复3次,以昆虫针轻触虫体蜷曲不动者为死亡。以蒸馏水处理为对照。

1.2.2 红棕象甲幼虫血淋巴总量测定 参考胡美英等(2002)的方法。以750条·mL-1嗜菌异小杆线虫H06品系处理红棕象甲8龄幼虫,处理方法同1.2.1。用电子天平准确称量处理后0、36、48、60和72 h的红棕象甲8龄幼虫活虫质量(精确至0.001 g),用昆虫针刺破胸部,挤出血淋巴,让其在吸水纸上爬行0.5 h后再次称质重,最后计算血淋巴总质量(每克幼虫体重中血淋巴的毫克数,mg·g-1)。以蒸馏水处理为对照。

1.2.3 红棕象甲血淋巴酯酶活性测定 采用陈长琨(1993)的方法。以750条·mL-1线虫液处理红棕象甲8龄幼虫,处理方法同1.2.1。在浓度为3×10-4mol·L-1的3 mLα-醋酸萘酯溶液中加入0.04 mol·L-1磷酸缓冲液(PBS)0.45 mL。摇匀后置于25 ℃下平衡5 min,各加入血淋巴0.05 mL,立即摇匀计时。25 ℃下平衡25 min,迅速加入显色剂0.5 mL (1%固蓝RR盐溶液+15%SDS,使用前2∶5混匀),终止反应并显色,30 min后待出现稳定的蓝绿色后,测定D600 nm值。以蒸馏水处理为对照。

1.2.4 红棕象甲血淋巴蛋白含量测定 采用考马斯亮蓝G-250法(陈钧辉等,2003)。以750条·mL-1线虫液处理红棕象甲8龄幼虫,处理方法同1.2.1。预先用0.5 mg·mL-1牛血清蛋白制作标准曲线。将处理后的红棕象甲血淋巴溶液0.2 mL加入蒸馏水0.8 mL,考马斯亮蓝试剂5 mL,摇菌放置20 min后,测定D595 nm值,对照标准曲线统计每毫升血淋巴中的蛋白质含量(mg·mL-1)。以蒸馏水处理为对照。

1.3 数据统计

参考黄剑和吴文君(2004)的方法,采用Excel统计软件求出毒力回归方程及LC50、LC50的95%置信区间等。

2 结果与分析

2.1 嗜菌异小杆线虫对红棕象甲不同虫态致病力的时间效应

嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲不同虫态的毒力水平和致死效果如表1和图1所示。以LC50为参考,随处理时间延长,嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲各虫态的毒力水平也呈现上升的趋势,其中以对卵的毒力水平最高。

图1 嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲不同虫态的致死率

表1 嗜菌异小杆线虫H06品系处理对红棕象甲的毒力

以处理后LC50的95%置信区间是否重叠为参考值,处理后3 d嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲各虫态的毒力以卵最高,而8龄幼虫、蛹和成虫处理组的毒力值未出现显著差异;处理后4和5 d后,对各虫态的毒力值仍以卵最高,其次为8龄幼虫和蛹,对成虫的毒力水平低于8龄幼虫处理组,但与蛹处理组差异未达到显著水平;在处理后期(6和7 d),嗜菌异小杆线虫H06品系对成虫的毒力水平均显著高于蛹处理组。

嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲不同虫态的致死率结果表明,随着处理时间的延长,红棕象甲的死亡率均呈现上升的趋势(图1)。

2.2 红棕象甲幼虫血淋巴总量的测定

经嗜菌异小杆线虫H06品系处理后,红棕象甲血淋巴总量呈现一个前期(0～48 h)升高,后期(48～72 h)逐渐降低的趋势,其中在处理后48 h的血淋巴总量为83.42 mg·g-1,与对照组相比升高273.75%,在60 h降低至与对照相当水平,处理后72 h的血淋巴总量为18.90 mg·g-1,与对照相比降低39.73%(图2)。

图2 嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫血淋巴总量的影响

2.3 红棕象甲幼虫血淋巴酯酶活性的测定

经嗜菌异小杆线虫H06品系处理后,红棕象甲血淋巴酯酶活性短期内(0～36 h)升高,处理后36 h的酯酶活性升高11.11%,之后逐渐下降,处理后60和72 h的血淋巴酯酶活性与对照相比分别降低10.18%和53.36%(图3)。

图3 嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫血淋巴酯酶活性的影响

2.4 红棕象甲幼虫血淋巴蛋白含量的测定

经嗜菌异小杆线虫H06品系处理后,红棕象甲幼虫血淋巴蛋白含量与对照相比呈现下降的趋势(图4)。处理后48～60 h呈现一个短暂的回升,之后又迅速下降,其中在处理后72 h,血淋巴的蛋白含量与对照相比下降74.96%。

图4 嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫血淋巴蛋白含量影响

3 讨论

昆虫不同虫态体内所含营养物质不同,如紫棕象甲Rhynchophorusphoenicis(Fabricius)高龄幼虫体内蛋白含量达10.51%,而成虫蛋白含量为8.43%(Omotoso &Adedire,2007)。EPNs侵入虫体后需取食虫体内营养物质才可完成增殖进而杀死寄主,寄主的龄期、虫态及体内激素分泌和免疫调节等均会影响线虫的寄生效果(刘勇,2020)。本研究中,嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲卵的毒力水平显著高于其他虫态,其次为幼虫和蛹,而对成虫的毒力水平最低,这可能与红棕象甲各虫态体内的营养物质差异有关。红棕象甲卵个体较小,仅需较少线虫个体即可达到对其致死的效果,同时EPNs在寄主体内会释放共生细菌引起细胞毒性,破坏免疫系统导致寄主死亡(Kaya &Gaugler,1993; Park &Kim,2000),线虫通过卵孔进入后,不仅取食卵内营养物质,且通过共生细菌破坏卵内细胞的分裂造成卵死亡;幼虫和蛹体内富含脂肪和蛋白质等营养物质(Khanitthaetal.,2020,2022),虽可为线虫提供繁殖所需营养,但体内的酯滴和蛋白又是虫体免疫的重要物质(葛君等,2010),对于缓解线虫内生细菌对寄主的伤害起到了一定作用。同时,本研究供试的8龄幼虫和蛹个体相对较大,嗜菌异小杆线虫H06品系需在虫体内增殖到一定数量才能对其起到致死效果;而成虫表皮甲壳致密坚硬且体内营养物质低于其他虫态,不利于EPNs侵染。

EPNs是昆虫专化寄生性天敌(丛斌等,1999),可通过寄主孔口、伤口等部位进入血腔后释放细菌(Poina &Thomas,1996),使寄主血淋巴表现出明显的病理学变化(孙昊雨等,2012),损坏寄主的免疫系统并最终导致寄主死亡。昆虫血淋巴中含有昆虫生理活性所需的一切代谢物质,对血淋巴成分和功能的干扰必然会影响其正常的代谢功能。在本研究中,经嗜菌异小杆线虫H06品系处理后,血淋巴总量前期迅速升高,而之后又降低,此趋势与丁晓帆等(2005)的研究相似,可能是由于在线虫侵染前期寄主防御系统开始起作用,血细胞开始大量分裂导致血淋巴总量急剧升高,之后随着病原线虫共生菌急剧增殖,红棕象甲血细胞快速崩解致使后期血淋巴总量减低。

酯酶广泛存在于昆虫体内,起着生化调节、神经传导及解毒代谢等作用(陈长琨,1993; 从斌等,1999)。肖猛(2000)和丁晓帆等(2005)采用EPNs接种家蚕BombyxmoriL.和大蜡螟Galleriamellonella(L.),均发现在供试时间内(0～24 h)血淋巴酯酶活性持续升高。本研究中红棕象甲受EPNs侵染后,血淋巴酯酶活性呈现前期(0～36 h)升高后期(36～72 h)降低的趋势。肖猛等(2000)认为,受线虫侵染后酯酶活性升高是由于对酯类物质分解增多和分解性酶活性的增强;在本研究后期出现的酯酶活性逐渐降低情况,笔者认为可能是由于在线虫侵染后期,随着EPNs和共生细菌在红棕象甲体内增殖,血淋巴内脂肪等物质被大量消耗,酯酶活性无法满足免疫需求,导致酯酶活性逐渐降低。

昆虫血淋巴蛋白与体内代谢、抗药性及免疫调节等功能密切相关,血蜱雌蜱受嗜菌异小杆线虫E67品系感染12 h后其血淋巴蛋白出现升高,在48 h后又出现显著降低(高志华等,2006)。孙昊雨等(2014)研究表明,蛴螬感染嗜菌异小杆线虫沧州品系后20 h内,血淋巴蛋白含量大幅度增加,随后急剧降低,感染线虫28 h后显著低于同时间的对照(P<0.05)。本研究中,嗜菌异小杆线虫H06品系侵染后,红棕象甲血淋巴蛋白含量呈现持续降低的趋势,虽在处理后60 h出现短暂的回升,但之后仍迅速降低。线虫侵染红棕象甲后,会大量消耗寄主体内的蛋白进行繁殖导致蛋白含量降低,但在60 h出现短暂回升的具体原因还有待进一步阐明。