金银花花蕾腺毛形态发生与生长动态△

汤慧敏，张珂洋，张国卉，王玲娜，2*，张永清，2*

1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；

2.山东省高校中药质量控制与全产业链建设协同创新中心，山东 济南 250355

表皮毛是植物为响应和抵御环境胁迫而由表皮细胞形成的特化结构，具有多种生物学功能，根据其是否具有分泌能力分为腺毛和非腺毛[1]。腺毛可合成、储存或分泌大量次生物质，被誉为“生物合成工厂”[2]。药用植物活性成分大多为植物次生物质，因此，药用植物腺毛的发生发育及其内含物与药材品质密切相关[3-4]。研究发现，黄花蒿、薄荷、紫苏等药用植物的腺毛起源于叶原基表皮细胞，经多次分裂形成数目不等的基细胞、柄细胞与头细胞[5-9]。

金银花是忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花，属常用大宗药材，可清热解毒、疏散风热，主治温病发热、痈疽疔毒、热毒血痢等[10-11]。金银花药材腺毛是其重要的显微鉴别特征，可据此辨别真伪、区分产地和评价品质[12-14]。前期有关金银花腺毛的研究多集中在密度、形态等方面，有报道早在花蕾三青期腺毛就已完成分化，后期只是腺头、腺柄体积增大[12-15]，均未涉及腺毛的起源与形态发生。本研究采集不同发育时期金银花花蕾，采用石蜡切片技术，观察确定腺毛的形态发生过程；通过制作临时装片，观察确定腺毛的生长动态，为金银花花蕾腺毛的深入研究，以及基于腺毛的药材质量评价和品种选育等提供参考。

1 材料

1.1 样品

金银花花蕾取自山东中医药大学药用植物园，经山东中医药大学张永清教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.，于花期选定植株随机摘取长度为1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mm的幼蕾，备用。

1.2 仪器

ICC50W 型数码相机、DM500 型光学显微镜（德国Leica 公司）；KD-2508 型石蜡切片机（上海珂淮仪器有限公司）；NanoZoomer S60型数字切片扫描仪（北京绿绵科技有限公司）；GFL-230 型恒温箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）；TB-718X 型生物组织自动包埋机（湖北泰维科技有限公司）。

1.3 试药

50%甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液（北京兰杰柯生物技术有限公司）；水合氯醛、甘油、石蜡、中性树胶（上海源叶生物科技有限公司）；1%番红水溶液、1%固绿酒精溶液（南京信帆生物有限公司）；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 花蕾保存

参考文献[16]方法，将采摘的新鲜花蕾剖开，去除雌蕊、雄蕊，置于50% FAA 固定液中固定24 h，然后放入50%乙醇中脱水2 h，最后置70%乙醇中保存。

2.2 临时装片与显微观察

采用花蕾表面制片。将保存在70%乙醇中的花蕾取出，置于载玻片上，滴加水合氯醛溶液[水合氯醛-水-甘油（10∶3∶2）]，微加热至有气泡产生，在样品呈半透明状态后，滴加1～2滴稀甘油[甘油-水（33∶100）]，制成临时装片。光学显微镜下观察花蕾中部不同视野内的腺毛细胞：10×4 倍镜下，随机取30 个视野，观察统计腺毛分布密度；10×10 倍镜下，在每个视野中随机选取3 个腺毛，观察统计完整腺毛腺头、腺柄大小；在10×40 倍镜下，观察腺毛腺头颜色。

2.3 石蜡切片

2.3.1 脱水与透明 将保存在70%乙醇中的花蕾取出，按照程序置入不同体积分数乙醇中脱水：1）80%乙醇2 h→90%乙醇2 h→95%乙醇2 h→95%乙醇2 h→无水乙醇1.5 h→无水乙醇1.5 h；2）将材料依次放入1/2 无水乙醇+1/2 二甲苯2 h、100%二甲苯1.5 h、100%二甲苯1.5 h进行透明处理。

2.3.2 浸蜡与包埋 在65 ℃恒温条件下，将透明后的材料依次放入1/2 二甲苯+1/2 石蜡中1 h、100%石蜡液1 h、100%石蜡液1 h 进行浸蜡处理，最后用包埋机包埋。

2.3.3 修片与切片 对包埋的材料进行修块、黏块、整修，保证材料四周都有适量石蜡，调整切片机进行切片。

2.3.4 黏片 用毛笔把切好的蜡带轻放在干净纸上，光面朝下。黏片前，在载玻片上用滴管将纯水滴成凸起的水条，选取合适蜡片轻放在水条上，用滤纸吸取多余水分，置40 ℃烘箱内烤片24 h。

2.3.5 脱蜡 依次将切片按照程序进行脱蜡：100%二甲苯20 min→100%二甲苯20 min→1/2 二甲苯+1/2 无水乙醇10 min→无水乙醇10 min→95%乙醇5 min→90%乙醇5 min→80%乙醇5 min→70%乙醇5 min→蒸馏水3 min。

2.3.6 染色与封片 先用1%番红水溶液染色20 min，蒸馏水洗涤3～5次，再用1%固绿酒精溶液染色30 s，将装片浸泡于75%乙醇中，1 min后取出，晾干，中性树胶封片。

2.4 图片与数据处理

采用数字切片扫描仪扫描制成的金银花花蕾组织切片，采用Motic DSAssistant Lite 软件观察切片扫描结果；采用Image J软件进行腺毛计数，测量腺头及腺柄的周长、面积；采用SPSS 28.0 软件进行数据分析。

3 结果

3.1 金银花花蕾腺毛形态发生

将发育程度不同的金银花花蕾制成石蜡切片，观察其腺毛形态发生情况，结果见图1。

图1 金银花花蕾腺毛形态发生（10×40）

《中华人民共和国药典》2020 年版记载，金银花腺毛较多，头部倒圆锥形、类圆形或略扁圆形，4～33 个细胞，排成2～4 层，直径30～108 μm，柄部1～5 个细胞，长可达700 μm[8]。金银花花蕾腺毛起源于幼小花蕾的表皮细胞，该腺毛原始细胞经伸长生长而凸出花蕾表面，逐渐成长为长椭圆形细胞，其细胞核不断向上移动，细胞核集中于细胞顶端（图1A）。此后该腺毛原始细胞进行第1 次不均等平周分裂，形成大小不等的2 个子细胞，下方的子细胞体积小，细胞核向下移动，以后发育成腺毛基部。上方的子细胞体积大，以后发育成腺毛柄部和头部（图1B）。上方子细胞体积迅速增大后，再次进行不均等平周分裂，形成大小不等的2 个子细胞，下方子细胞与基部相连（图1C），上方子细胞不进行或进行多次平周分裂，形成与基细胞相连的单列3～5个细胞。最上面的细胞形成腺毛分泌细胞的原始细胞，经平周分裂使腺毛头部细胞层数增加，形成单列的4～6 个细胞（图1D、图1E），每层的分泌细胞还可进行多次连续的均等和不均等的垂周分裂，使头部细胞数目不断增加（图1F～图1H），最终发育形成多细胞腺毛头部（图1I）。每层分泌细胞进行垂周分裂的时间常存在差异，有的第1 层分泌细胞先进行垂周分裂（图1F），有的第2层分泌细胞先进行垂周分裂（图1G）。在腺毛头部细胞垂周分裂使头部细胞不断增加的过程中伴随着基细胞及其上方的1～3 个细胞迅速增大、伸长，发育形成柄细胞的过程（图1H）。最终发育形成的腺毛柄部如图1J所示。腺毛头部细胞刚结束分裂形成完整腺毛时，头部细胞排列紧密（图1I），之后细胞继续分化，细胞体积增大，头部细胞间出现细胞间隙（图1J），标志腺毛发育成熟。

3.2 金银花花蕾腺毛生长动态

3.2.1 腺毛密度变化 为了解花蕾发育过程中腺毛密度的变化，分别在花蕾长1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mm 时，统计显微镜下每个视野中的腺毛个数，结果见表1、图2。

表1 不同发育程度金银花花蕾外表面腺毛密度（,n=30）

表1 不同发育程度金银花花蕾外表面腺毛密度（,n=30）

注：采用Duncan′s multiple range test方法分析，同列不同字母表示P<0.05；表2同。

图2 不同发育程度金银花花蕾外表面腺毛（10×4）

由表1、图2 可知，在花蕾幼小时期，随着花蕾发育，腺毛密度是不断增加的。1.0 mm 与2.5 mm、2.5 mm 与5.0 mm、5.0 mm 与7.5 mm 花蕾之间差异均有统计学意义（P<0.05），花蕾长1.0～5.0 mm时是腺毛“迅速涌现”期；在花蕾长7.5～10.0 mm时，虽然腺毛密度仍然有所增加，但差异无统计学意义，提示腺毛分化基本完成，腺毛密度趋于稳定。

3.2.2 腺毛大小变化 在幼小花蕾逐渐发育过程中，腺毛大小的变化情况见表2。由表2 可知，在幼小花蕾不断发育长大的过程中，腺毛也在不断长大，表现为腺头面积、腺头周长、腺柄面积、腺柄周长均在不断增加。其中，花蕾长5.0～7.5 mm时期是腺毛“迅速膨大”期，腺头面积、腺头周长在花蕾长10.0 mm 时仍在呈明显增长趋势，而腺柄面积、腺柄周长在花蕾长7.5 mm 时虽然仍有增加，但与长10.0 mm 的花蕾差异无统计学意义，提示在金银花幼蕾长度为7.5 mm时，腺毛腺头可以进一步明显增大，但腺柄面积与周长不再明显增加，表明腺柄生长趋于稳定。

表2 不同发育程度金银花花蕾外表面腺毛大小（,n=90）

表2 不同发育程度金银花花蕾外表面腺毛大小（,n=90）

3.2.3 腺毛腺头颜色变化 腺头是腺毛进行次生代谢、合成积累次生物质的主要场所，其面积与周长随着花蕾发育不断增加，同时其颜色也在不断发生变化（图3）。

图3 不同发育程度金银花花蕾外表面腺毛颜色（10×40）

由图3 可知，1.0、2.5 mm 长花蕾腺毛腺头多呈浅黄色和橘黄色，5.0 mm 长花蕾多呈橘黄色和深橘黄色，7.5 mm 长花蕾多呈黄棕色，10.0 mm 长花蕾多呈棕褐色，即随着幼蕾长度增加，腺毛腺头颜色逐渐加深。这提示在花蕾长约1.0 mm时就已经开始合成积累有色的次生物质，随着花蕾发育，腺头中合成积累的有色次生物质数量不断增加。

4 讨论

腺毛是植物次生物质合成积累的主要场所，也是药材鉴别的重要特征[12]，如根据腺毛和非腺毛的形态可以区分金银花和其近源植物金银忍冬[13]。本研究发现，金银花花蕾腺毛起源于幼嫩花蕾表皮细胞，原表皮细胞凸出花表，形成腺毛原始细胞，腺毛原始细胞经一系列平周与垂周分裂发育形成完整腺毛。观察金银花花蕾腺毛的生长动态发现，金银花花蕾腺毛发生在花蕾形态建成之后，在幼蕾长约1.0 mm 时才开始出现腺毛。在花蕾短于1.0 mm 时就有非腺毛存在，表明金银花花蕾非腺毛的发生要早于腺毛，这可能与非腺毛能够抵御紫外线损伤有关[17]。

花蕾长1.0～5.0 mm 时是腺毛的“迅速涌现”期。在花蕾增长发育过程中，表皮细胞增多，会有新的表皮细胞分化，从而部分新的表皮细胞形成新的腺毛。在花蕾从短变长的发育过程中，同时存在不同大小的腺毛。笔者分别在每个时期的样品中随机选取了30 个视野统计腺毛数量，每个视野中又随机选取了3 个腺毛统计其大小，通过计算得出每个视野下腺毛的平均密度及每个腺毛的平均大小。结果发现，虽然腺毛密度不断增加，但腺毛大小总体也在增大，这意味着腺毛体积增大的幅度远大于腺毛密度增加的幅度。笔者观察到花蕾长7.5～10.0 mm时，腺毛分化基本完成，密度趋于稳定，但腺毛大小总体还在不断增大。腺毛形成后，腺头颜色逐步加深，提示合成积累的有色次生物质不断增多。观察发现，金银花花蕾腺毛发育趋势与腺头颜色变化趋势基本一致，表明腺毛发育与某些次生物质的合成积累密切相关，通过调控腺毛发生和发育可以调控金银花药材质量。因此，深入研究金银花花蕾腺毛发生机制及其次生物质合成积累规律，可为提高和稳定金银花药材质量提供新的方法和思路。