岭南有毒中草药精准识别质谱数据库及快速检测方法的建立△

刘潇潇，张万青a，王莹，陆佳，戴玉豪，马双成*，吴群悦*

1.广东省药品检验所，广东 广州 510663；

2.中国食品药品检定研究院，北京 102629

有毒中草药的安全性问题一直是中医药领域的研究热点。有毒中草药是中药的重要组成部分。毒性物质指药用动植物经生物代谢形成的一类有毒性的物质[1]。1988 年发布的《医疗用毒性药品管理办法》收载了洋金花、雪上一支蒿等毒性剧烈、使用不当会致人中毒或死亡的28 个中药品种；《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版对毒性药材采用大毒、有毒、有小毒分级管理，共收载川乌、马钱子、闹羊花等83 个中药品种[2]。此外，地方药材标准也收载了很多有毒的中草药[3]。广东省地处岭南地区，拥有丰富而独特的中草药资源。长期以来，岭南中草药已广泛融入当地人民生活。然而，岭南地区有毒中草药种类众多，在记载的品种中，有毒中草药占1/10，如剧毒中药钩吻、见血封喉、马钱子等。这些有毒中药与常用药材生境类似，在使用中草药治病保健、煲汤饮茶的过程中，用药过量、误食等造成的中毒事件数量呈上升趋势。中国疾病预防控制中心卫生应急中心统计数据显示，2004—2013 年全国共报告钩吻中毒事件21起，累计报告中毒124人，死亡31人[4]；2018年全国共报告7 起钩吻中毒事件，死亡率高达27.3%[5]。2015 年以来，本实验室开展了多起中草药中毒应急检验，检测样品包括原植物、药材鲜品、饮片、药材粉末、药渣、中药汤剂、药酒等。中毒事件属于突发公共卫生事件，需短时间内查明中毒原因，迫切需要建立有毒中药精准识别和快速测定的检验检测方法。

中药毒性成分种类复杂多样，如生物碱类、苷类、毒蛋白类、萜类、内酯类、金属元素类等，常用的检测方法有薄层色谱法[6]、液相色谱法[7]、高分辨质谱法[8]等。超高效液相色谱串联质谱法（UPLCMS/MS）具有高选择性和高灵敏度的特点，广泛应用于中药中农药监测、真菌毒素检测。本研究选取岭南常见毒性药材及相关特征性毒性成分，采用UPLC-MS/MS 技术，建立33个毒性成分的精准识别及快速测定方法。该方法快速、准确、通量高，可缩短中毒事件品种排查的应急处置时间，为进一步开展中药材风险评估和药物警戒提供技术支撑。

1 材料

1.1 仪器

Xevo™ TQ-S 型三重四级杆质谱联用仪（美国Waters 公司）；BCE6202-1CCN 型电子天平（德国Sartorius 公司）；M8800H-C 型超声清洗器（美国必能信公司）；ST16R 型离心机（美国Thermo 公司）；Milli-Q Academic 型超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 试药

对照品雷公藤内酯甲（wiforlide A，批号：111597-200505）、雷公藤甲素（triptolide，批号：111567-201404）、雷公藤红素（celastrol，批号：111946-201501）、马兜铃酸Ⅰ（aristolochic acid A，批号：110746-201912）、秋水仙碱（colchicine，批号：101176-201202）、雪上一支蒿甲素（bullatine A，批号：110895-202105）均购于中国食品药品检定研究院；对照品马钱子碱（士的宁）（strychnine，批号：110705-200005）、商陆皂苷甲（esculentoside A，批号：111922-201102）、莨菪碱（hyoscyamine，批号：0049-9507）、东莨菪碱（scopolamine，批号：100476-200301）、山莨菪碱（anisodamine，批号：100130-201103）、阿托品（atropine，批号：100135-201304）、乌头碱（aconitine，批号：112019-201601）、次乌头碱（hypaconitine，批号：110798-201308）、新乌头碱（mesaconitine，批号：110799-201608）均购于中国药品生物制品检定所；对照品钩吻素甲（gelsemine，批号：110705-200005）、钩吻素己（gelsenicine，批号：110705-200005）、钩吻素子（koumine，批号：110705-200005）、相思子碱（abrine，批号：S14M6G2）、欧夹竹桃苷（oleandrin，批号：Y31D5W1）、血根碱（sanguinarine，批号：S7Y5E1）均购于上海源叶生物科技有限公司；闹羊花毒素Ⅱ（rhodojaponinⅡ，批号：22061422）、闹羊花毒素Ⅲ（rhodojaponinⅢ，批号：22061324）、毒扁豆碱（physostigmine，批号：0818-RD-0018）、卡茄碱（alpha chaconine，批号：CS30062-69727）、茄碱（alpha solannine，批号：22020933）、鬼臼毒素（podophyllotoxin，批号：22061139）、马兜铃酸Ⅱ（aristolochic acid B，批号：3519）均购于成都埃法生物科技有限公司；α-鹅膏毒肽（α-amanitin，批号：S089723）、β-鹅膏毒肽（β-amanitin，批号：S096921）、γ-鹅膏毒肽（γ-amanitin，批号：S099339）、羧基二羟基鬼笔毒肽（phallacidin solution，批号：S091333）、二羟基鬼笔毒肽（phalloidin solution，批号：S090315）均购于天津阿尔塔科技有限公司，对照品纯度均大于98%。乙腈和甲酸为色谱纯（德国Merck公司）；甲酸铵（美国Thermo-Fisher公司）；亲水亲油平衡（HLB）材料固相萃取（SPE）柱（规格：6 mL/200 mg，北京迪马科技有限公司）。

样品13 批，来源于广东省药品检验所收检的中草药中毒应急检验样品。未知药粉1 号（编号：YJJY001）、未知药粉2 号（编号：YJJY002）、未知药粉3 号（编号：YJJY003）、未知药粉4 号（编号：YJJY004）、未知药粉5 号（编号：YJJY005）均为珠海市公安局香洲分局送检；标示为药酒及药渣的样品（编号：YJJY006，台山市食品药品监督管理局送检）、未知药材（编号：YJJY007，汕尾市食药监局稽查局送检）、标示为五指毛桃的样品（编号：YJJY008，中山市食药监局稽查局送检）、标示为药酒及药渣的样品（编号：YJJY009，审计署广州特派办送检）、标示为黑老虎的样品（编号：YJJY010，韶关市市场监督管理局送检）、未知中药材包（编号：YJJY011，卓资县公安局送检）、标示为鸡屎藤的样品（编号：YJJY012，揭阳市药品检验所送检）、标示为苦心根（编号：YJJY013，江门市药品检验所送检）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取上述各对照品约10 mg，分别置于50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取各单标储备溶液适量混合，加甲醇配制成含每种对照品2 μg·mL-1的混合对照品溶液。精密吸取混合对照品溶液，用甲醇稀释4、10、20、40、100、200、400倍，作为系列混合对照品溶液。

2.2 样品溶液制备

原植物、饮片、药材粉末、药渣等固体样品的提取：精密称取样品（固体打粉，过三号筛）1 g，置50 mL 聚丙烯离心管中，加甲醇10 mL，超声处理30 min，4000 r·min-1离心5 min（离心半径为9.47 cm），取上清液，滤过，即得。

中药汤剂、药酒等液体样品的提取：精密量取样品1 mL，置50 mL聚丙烯离心管中，加甲醇10 mL，超声处理30 min，4000 r·min-1离心5 min（离心半径为9.47 cm），取上清液，滤过，即得。

提取溶液的净化：对于复杂基质样品，可采用以下方法净化后再检测。精密量取提取液5 mL，缓慢通过已经处理好的HLB 柱，依次用甲醇和水各5 mL洗脱，至有适量空气通过，收集洗脱液，随后用甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液，合并2次洗脱液，置氮吹仪中，于40 ℃水浴缓慢浓缩，加甲醇定容至5 mL，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

2.3.1 液相条件 色谱柱：Poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 µm）；柱温：35 ℃；进样体积：1 μL；流速：0.3 mL·min-1；以0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸铵，A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0～1 min，10%B；1～12 min，10%～70%B；12～22 min，98%B）。

2.3.2 质谱条件 采用三重四级杆质谱仪检测，离子源为电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式，监测模式为多反应监测（MRM），各毒性成分的tR、监测离子对、碰撞电压（CE）见表1。

2.4 定性测定

分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各1 µL，注入色谱仪，根据tR、离子对信息、相对离子丰度综合判断定性。在允许范围内可判定样品中是否存在该成分。33个毒性成分总离子流色谱图见图1。

图1 33个毒性成分总离子流色谱图

2.5 定量测定

2.5.1 线性关系考察 将2.1 项下所得系列混合对照品溶液注入色谱仪，以各分析物对照品质量浓度为横坐标（X），各对照品定量离子对响应峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。各毒性成分定量限（LOQ）为2～5 ng·mL-1，检出限（LOD）为0.3～2.0 ng·mL-1，33 个毒性成分线性方程、定量限及检测限见表2。结果表明，各毒性成分测试线性方程的r均大于0.99，表明有较好的线性关系。

表2 33个毒性成分线性方程、定量限及检测限

2.5.2 稳定性试验 精密吸取2.1 项下配得的混合对照品溶液样品（50 ng·mL-1），分别于配制后的0、4、8、12、16、18、24 h，按上述设定的色谱与质谱条件进样分析，测定各分析物的峰面积，测试结果表明，33 个对照品测试峰面积的RSD≤13.04%，说明对照品溶液稳定性良好。

2.5.3 精密度试验 精密吸取2.1 项下配得的混合对照品溶液样品（50 ng·mL-1），按上述设定的色谱与质谱条件连续进样6 次，以各分析物对照品质量浓度为横坐标，对照品定量离子对响应峰面积作为纵坐标，计算得各对照品RSD≤13.57%，表明仪器的精密度良好。

2.5.4 准确度考察 实验方法学的准确度用回收率表示，精密度用回收率RSD 表示。取空白样品，精密加入混合对照品贮备溶液适量，设定添加水平分别为500 ng·mL-1，测定时每种添加水平重复6 次。以各对照品质量浓度为横坐标，对照品定量离子对响应峰面积作为纵坐标，计算回收率。结果表明，各对照品平均回收率为67.85%～109.53%，RSD≤15%，符合《中国药典》2020 年版（四部）有关方法学验证过的相关要求[9]（表3）。

表3 33个毒性成分精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验考察结果（n=6） %

2.6 样品分析

在处置突发公共卫生事件中，本实验室围绕应急检验“排查原因要快，检验结果要准”的目标导向，构建了岭南常见有毒中草药精准识别质谱数据库和快速检测方法，建立了中草药中毒安全突发事件应急检验新体系。2015 年以来，本实验室采用建立的方法，完成多例危害人民群众生命安全的有毒中药材中毒的应急检验，涉及西藏，内蒙古，广东省梅州市、中山市、汕尾市、台山市、韶关市、揭阳市等地[10-11]，检出毒性成分钩吻素子、钩吻素甲、东莨菪碱、乌头碱、马钱子碱，确定有毒中草药来源为钩吻、洋金花、川乌、制附子、雪上一支蒿、马钱子。应急检验体系的建立为有关部门锁定问题原因、正确处置赢得了宝贵时间，为行政监管提供了强有力的技术支撑。岭南有毒中草药精准识别质谱数据库及快速识别检测方法对各类样本均适用，可进一步简化操作流程，缩短检验时间，提高检验效率和准确率。结合其他鉴别手段，可基本确定导致中毒的中草药。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本研究考察的有机相有甲醇和乙腈，以乙腈为有机相时各毒性成分峰形较好。因分析物中生物碱类成分较多，为增强目标成分的离子化强度、改善峰形，在水相中加入了0.1%甲酸和5 mmol·L-1甲酸铵，优化了流动相梯度，兼顾分离效率和分离度。

3.2 前处理方法考察

复杂中药基质需要净化，中药毒性成分复杂多样，净化方式也不同[12-13]，实际检验中可根据基质情况选择适合的净化方式。本研究考察了QuEChERS和HLB 固相萃取柱法2 种净化方式，最终选择采用HLB固相萃取柱法净化。

3.3 检验结果的判定

本研究中雷公藤红素、商陆皂苷甲回收率较低，仅用于定性。实验室可根据自身条件和样品状态，结合各类检测手段与临床中毒症状综合分析。具备特征性外观性状的样品（如原植物、饮片、药渣等），在鉴别时可用质谱数据库与性状鉴别、薄层色谱鉴别、显微鉴别等结果相互佐证；对于不具特征性外观性状样品（如粉末、中药汤剂、药酒等）的鉴别，有毒植物精准识别的毒性成分质谱库尤为重要。通过数据库检索可快速识别毒性物质，为检验指明方向。

4 小结

开展有毒中草药的安全监管工作，符合国家药品监督管理局《“十四五”国家药品安全及促进高质量发展规划》中“要强化中药质量安全监管、要建立健全药物警戒体系”的顶层规划[14]，对确保大众安全用药、提升中医药现代化水平具有重要意义。目前，有毒中草药的物质基础及中毒机制研究尚不充分，高通量、快速精准识别有毒成分的检测方法也相对薄弱，有毒中药科学监管、中毒事件溯源调查等方面的技术储备尚需加强。

本研究涉及品种来源于中药标准、检验案例及历年来我国植物性食物中毒流行病报告，覆盖面较广，但筛查数据库有待进一步补充完善。本研究建立的SPE-UPLC-MS/MS 精准识别和快速测定毒性中药材中33 个毒性成分的方法，灵敏度高、稳定性好、回收率高，能快速对上述33 个毒性成分进行定性和定量分析，可满足日常检测和风险筛查要求，为科学监管提供了支撑。