昆仑雪菊黄酮类提取物抗脂多糖诱导的小胶质细胞活化作用及网络药理学机制分析△

滕李利，钟奕，戚舜尧，孙乐，马培*，许利嘉，肖培根

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；

2.中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193

小胶质细胞与大脑炎症和炎性神经退行性疾病密切相关，神经炎症的第一个指征是小胶质细胞激活[1-2]。神经炎症发生后，小胶质细胞释放肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β等促炎因子，与血管内皮细胞、神经元等相互作用，导致神经元死亡及脱髓鞘损伤。针对该过程的治疗是延缓帕金森病（PD）、阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）、血管性痴呆（VaD）等引起的认知障碍的重要策略。目前已有靶向核苷酸寡聚化结构域（NOD）样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、IL-1 受体、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的抑制剂控制AD、PD、肌萎缩侧索硬化症（ALS）的神经炎症，但具有感染的可能性较大等特点[3-4]。因此，寻找不良反应较小的靶向小胶质细胞的药物具有重要意义。

中药治疗多种慢性低程度炎症导致的疾病有效果明显、不良反应较少等优势[5]。两色金鸡菊Coreopsis tinctoriaNutt.又称为昆仑雪菊，具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗癌、抗菌、防治“三高”及心脑血管疾病等药理活性[6]。多项研究证实，昆仑雪菊及其黄酮类提取物可以抑制肥胖、糖尿病相关的慢性炎症，也对急性肝损伤状态下的炎症因子释放有明显的抑制作用[6-7]，黄酮是其主要活性成分。本课题组研究表明，昆仑雪菊对神经退行性病变有潜在作用[8]，但昆仑雪菊通过调节小胶质细胞发挥神经保护作用的机制尚无系统性研究。本研究基于体外细胞实验结合网络药理学，分析昆仑雪菊黄酮类成分作用于小胶质细胞的靶点和通路，为靶向小胶质细胞介导的神经相关疾病的临床治疗和研究提供新思路和依据。

1 材料

1.1 细胞

小鼠BV2 小胶质细胞由中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。

1.2 试药

昆仑雪菊黄酮类提取物由本课题组前期制备（昆仑雪菊头状花序加80%甲醇回流提取、浓缩，收集70%乙醇洗脱大孔树脂柱色谱的部分浓缩成浸膏，得到昆仑雪菊黄酮总提取物），经超高效液相色谱法（UPLC）[9]及液相色谱-质谱法（LC-MS）[10]分析，鉴定得到9 个黄酮类成分，分别是奥卡宁、金鸡菊苷、马里苷、紫铆花素、槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖、槲皮素-7-β-O-葡萄糖、圣草酚、异奥卡宁、异奥卡宁-7-O-β-D-葡萄糖。以上化合物的总质量分数达69.99%，提取物以黄酮类成分为主。

DMEM 高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰酶均购于美国Gibco 公司；细胞增殖活性检测试剂盒（CCK-8，北京索莱宝生物科技有限公司）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（碧云天生物技术公司）；小鼠白细胞介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（美国Biolegend生物科技有限公司）；脂多糖（LPS，美国Sigma-Aldrich公司，纯度99%，批号：L2880）。

1.3 仪器

Tecan Spark型多功能酶标仪（瑞士迪肯公司）。

2 方法

2.1 昆仑雪菊黄酮类提取物抑制LPS诱导的小胶质细胞激活的作用

2.1.1 细胞培养 复苏BV2 细胞，显微镜下观察，细胞生长密度>80%则传代后放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

2.1.2 CCK-8法检测昆仑雪菊黄酮类提取物对细胞生长的影响 取对数生长期BV2细胞，以3×104个/孔的密度接种于96 孔板，过夜培养。细胞分为对照组和昆仑雪菊提取物（500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8 μg·mL-1）组，每组6 个复孔。给药处理24 h 后，加入CCK8（10 μL/孔）孵育1 h，测定450 nm处的吸光度（A450nm）。

2.1.3 Griess法检测昆仑雪菊黄酮类提取物对NO产生的影响 取对数生长期的BV2细胞，以1×105个/孔接种于48 孔板过夜培养。设对照组和昆仑雪菊提取物（0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL-1）组，加入对应质量浓度提取物作用4 h 后加入LPS（1 μg·mL-1）孵育24 h。收集上清液，按试剂盒说明书检测NO产生情况。

2.1.4 ELISA 法检测昆仑雪菊黄酮类提取物对IL-6产生的影响 细胞处理同2.1.3 项下。取标准稀释液或样品100 μL，按试剂盒说明书操作。停止反应15 min内读取A450nm和A507nm。

2.2 昆仑雪菊黄酮类提取物抑制小胶质细胞活化的网络药理学机制分析

2.2.1 昆仑雪菊黄酮类成分、靶点的收集与整理 采用自建昆仑雪菊成分、靶点数据集[8]，提取昆仑雪菊9 个主要成分的生物利用度、化合物结构和靶点信息，进行整合。

2.2.2 小胶质细胞核心功能靶点收集 以“microglia”为关键词在GeneCards（https://www.genecards.org/）、Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）数据库中检索小胶质细胞功能相关靶点。去除GeneCards 中评分<0.5 的靶点，选取Gene 数据库中相关性为前80%的靶点，去除重复基因和假阳性基因。采用STRING 数据库（https://cn.string-db.org/）富集相关性>0.9 的靶点，即为小胶质细胞功能相关核心靶点集合。

2.2.3 昆仑雪菊干预小胶质细胞功能的靶点筛选 应用R 语言获取2.2.1 与2.2.2 项下靶点的交集，即昆仑雪菊干预小胶质细胞功能的直接靶点。将直接靶点导入GeneMANIA（https://genemania.org/）数据库，限定物种为人源，获取间接靶点，两者合并为昆仑雪菊干预小胶质功能的潜在靶点集。

2.2.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将靶点集导入STRING 数据库，限定物种为“Homo sapiens”，获得PPI文件。采用Cytoscape 3.8.0软件可视化，利用cytoHubba 模块得到排名前30 位的核心靶点的相互作用，利用NetworkAnalyzer分析节点的度值及相关参数。

2.2.5 分子特征数据库（MSigDB）的Hallmark 条目富集分析 MSigDB 是一个收录了带有注释的基因集的数据库，使用基因集富集分析（GSEA 4.3.2）软件分析昆仑雪菊调控靶点在Hallmark基因集中的富集条目。对错误发现率（FDR）的负对数（P值）排名前10 的条目通过R 语言进行可视化分析。

2.2.6 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析 使用Bioconductor数据库（https://www.bioconductor.org/）中的“org.Hs.eg.db”人类数据库，通过R 语言“clusterProfiler”“enrichplot”和“stringi”等包对昆仑雪菊调控靶点进行GO和KEGG功能富集条目分析。对P值排名前20的条目通过R语言进行可视化分析。

2.2.7 昆仑雪菊化合物-靶点-靶点生物功能网络的构建 以昆仑雪菊调控靶点集反向筛选对应活性成分，采用Cytoscape 软件构建化合物-靶点-靶点生物功能网络，运用NetworkAnalyzer功能进行拓扑分析。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 昆仑雪菊黄酮类提取物抑制小胶质细胞NO 和IL-6的产生

图1 表明，昆仑雪菊总黄酮质量浓度为7.8～500.0 μg·mL-1时，对BV2 细胞未见明显毒性作用。Griess法和ELISA法检测结果表明，LPS显著诱导小胶质细胞产生NO 和IL-6（P<0.001），与模型组比较，昆仑雪菊总黄酮显著抑制NO 和IL-6 的分泌（P<0.05，P<0.01）。

图1 昆仑雪菊总黄酮对BV2细胞的作用（,n=3）

3.2 昆仑雪菊黄酮类提取物抑制小胶质细胞活化的成分分析

9 个昆仑雪菊黄酮类成分属于查耳酮、黄烷酮和黄酮醇（表1，图2），生物利用度得分均大于0.15，对应靶点校正后得到178个人源蛋白靶点。

图2 昆仑雪菊中主要的黄酮类成分

3.3 昆仑雪菊作用于小胶质细胞的核心功能靶点筛选

在GeneCards、GENE 数据库中分别检索到小胶质细胞功能靶点1013、734 个，删去重复和相关性<0.9 的靶点，共得到小胶质细胞核心功能靶点830个。

将昆仑雪菊成分的178 个靶点与小胶质细胞的830 个靶点对比，得到64 个直接靶点，经GeneMANIA 分析，合并得到昆仑雪菊作用于小胶质细胞的靶点205个（图3）。

图3 昆仑雪菊靶点的分布情况

3.4 PPI网络的构建

通过STRING 数据库获取昆仑雪菊干预小胶质细胞功能的靶点PPI网络，该网络中包含了243个节点，1492 条边（图4）。节点由浅变深，由小变大表明度值逐渐增大。根据度值判断靶点的重要性，并由CytoHubba 计算TOP30 核心靶点，发现蛋白激酶B（Akt，度值=169）、IL-6（度值=158）、TNF（度值=157）、TP53（度值=152）、SRC（度值=149）、表皮生长因子受体（EGFR，度值=148）、JUN（度值=143）、信号转导和转录激活因子3（STAT3，度值=142）、丝裂原活化蛋白激酶3（MAPK3，度值=141）、CTNNB1（度值=139）等度值较高，是主要潜在作用靶点。因此，昆仑雪菊可能通过这些靶点改善小胶质细胞活化。

图4 昆仑雪菊作用于小胶质细胞靶点PPI网络的构建

3.5 昆仑雪菊作用于小胶质细胞靶点的富集分析

9 个化合物调控靶点在Hallmark 基因集中富集的前10个条目有TNF-α通路、补体途径、凋亡、IL-6-JAK 信号通路等（图5）。马里苷和异奥卡宁-7-Oβ-D-葡萄糖苷仅调节TNF-α和上皮间质转化相关通路，紫铆花素、圣草酚、异奥卡宁、奥卡宁、槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷有广泛的协同作用，对每一个条目富集了较多靶点。

图5 昆仑雪菊调控小胶质细胞相关靶点的Hallmark基因富集分析

3.6 昆仑雪菊作用于小胶质细胞靶点的GO 和KEGG富集分析

对昆仑雪菊作用于小胶质细胞的关键靶点进行基因的功能注释及通路富集分析，结果表明关键靶点分别参与了2561 个生物过程（BP）条目、161 个细胞组成（CC）条目、230 个分子功能（MF）条目。根据P值，通过R 软件可视化前20 条目（图6）。图中柱长越长，表明该条目富集基因数目越多，柱颜色越深，表明P值越小。结果表明，昆仑雪菊作用于小胶质细胞的靶点参与的BP 主要有磷酸化的正向调节、防御反应的调节、运动的正向调节、细胞激活等；CC 主要有突触后膜、树突、膜筏、膜微区等；MF 主要有激酶结合、蛋白质结构域特异性结合、转录因子结合、蛋白激酶活性等。

根据P值，通过R 语言可视化前20 条KEGG 富集通路（图7）。在总188 个KEGG 条目中，昆仑雪菊总黄酮发挥主要作用有癌症信号通路、脂质与动脉粥样硬化信号通路、磷脂腺肌醇3-激酶（PI3K）-Akt 信号通路、T 细胞受体（TCR）信号通路、辅助性T 细胞17（Th17）信号通路、TNF 信号通路、JAK-STAT信号通路、MAPK通路等。多数黄酮类成分如紫铆花素、圣草酚、异奥卡宁、奥卡宁、槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖和槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷在以上通路上具有广泛的调控作用，这些信号通路已被证实与肿瘤类疾病、代谢类疾病、神经退行性疾病相关。

图7 昆仑雪菊作用于小胶质细胞关键靶点的KEGG分析

3.7 昆仑雪菊化合物-靶点-通路网络的构建

昆仑雪菊9 个化合物调控小胶质功能的前20 条通路涉及151 个靶点（图8），主要分布在炎症、免疫、细胞增殖分化及凋亡相关通路等。炎症相关通路涉及到TNF通路，核转录因子-κB（NF-κB）通路和JAK-STAT 通路等。免疫相关通路有TCR 通路、Th17 细胞分化通路、Toll 样受体（TLR）通路等。细胞增殖分化及凋亡相关通路有MAPK通路、PI3KAkt 通路、低氧诱导因子-1（HIF-1）通路等。IL-6、STAT3、MAPK1、MAPK3、TLR4、TNF、Akt 等靶点在以上多个条目中起广泛作用。奥卡宁、异奥卡宁、圣草酚及槲皮万寿菊素-7-O-β-D-葡萄糖对涉及到的通路有较明显的调控作用。

图8 昆仑雪菊化合物-靶点-通路网络

4 讨论

神经胶质细胞主要包括小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。小胶质细胞起源于卵黄囊，是主要的脑部免疫细胞，在退行性疾病、感染、中风等的神经炎症过程中发挥主要作用。氧化应激、炎症因子等可激活小胶质细胞的NLRP3 炎性小体及Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、MAPK等，影响NF-κB 的磷酸化和泛素化，促使炎症因子和趋化因子的转录和翻译，导致TNF-α、IL-1β、COX-2 和iNOS 等的表达[11]，最终造成神经元死亡及脱髓鞘损伤[12]。而与促炎机制相反，PPARγ上调抗炎相关基因，干预小胶质细胞的激活和炎症反应[13]。靶向NLRP3、IL-1 受体抑制剂及PPARγ激活剂等在治疗神经退行性病变中有较好疗效，但也有机会感染风险上升等缺点[14]。由于多数调节小胶质细胞功能治疗神经炎症药物具有不可忽视的不良反应，因此寻找新的靶向疗法具有重要意义。

黄酮类成分存在于各种植物中，能够通过调节小胶质细胞选择性活化和功能干预神经炎症，对AD、PD、HD 等神经退行性疾病的炎症过程有良好的防治效果[15]。前期课题组证实昆仑雪菊黄酮成分有神经保护作用，但其对小胶质细胞的干预机制还未深入探讨[10]。网络药理学依靠网络靶标理论、大数据和人工智能等手段，并结合生物信息学等在整体分子水平上阐释中药相关活性成分、药物作用机制及潜在靶点机制的相互关系，是研究中药黄酮类成分的合适手段[16-17]。本研究首先探究昆仑雪菊总黄酮对LPS 诱导BV2 细胞的干预作用，结果表明昆仑雪菊总黄酮的确可以降低小胶质活化时产生的NO、TNF-α等促炎因子水平。对昆仑雪菊主要黄酮类成分干预小胶质功能的靶点进行PPI 网络分析，结果证实昆仑雪菊黄酮类成分作用于Akt、TNF、IL-6、TP53、SRC、EGFR、JUN、STAT3、MAPK3、CTNNB1 等靶点干预小胶质细胞的功能。对功能靶点富集的Hallmark、GO、KEGG 条目分析，发现主要通路有PI3K-Akt、MAPK、TNF、JAK-STAT 信号通路等，广泛调控运动、炎症应答、神经细胞死亡等生物过程。这些蛋白可能在昆仑雪菊黄酮对小胶质细胞的干预作用中发挥重要作用。有研究表明，PI3K-Akt 通路调节小胶质细胞的吞噬功能及表型转化，参与小胶质细胞介导的神经炎症[18]。小胶质细胞能够调节多种TNF 的分泌；STAT3、MAPK1、MAPK3等靶点在脑组织局部缺血导致的神经炎症中发挥重要作用，小胶质细胞极化后通过NF-κB、MAPK 和JAK2/STAT3 等通路促进炎症因子的产生[19-20]；在AD中Aβ蛋白可激活胶质细胞并诱导IL-6等多种炎性因子表达[21]；TLR4、Akt 等靶点在脑卒中、PD等疾病中起到多种作用[22-23]。

本研究结果表明，昆仑雪菊总黄酮对BV2 未见明显的增殖抑制活性，在LPS 激活的BV2 细胞中，可以显著缓解炎性因子NO 和IL-6 的分泌。结合网络药理学分析的结果，昆仑雪菊总黄酮可通过多靶点、多途径发挥调节小胶质细胞活化的作用。