高聚合度菊粉通过调节肠-脂肪组织轴改善高脂饮食诱导的犬肥胖

陆 江,朱道仙,卢劲晔*,刘 莉,郝福星,吴 植,卢 炜,刘 静

(1.江苏农牧科技职业学院宠物科技学院,泰州 225300;2.江苏农牧科技职业学院动物医学院,泰州 225300;3.江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,泰州 225300)

肥胖是犬最常见的代谢性疾病之一,近年来发病率不断升高,成为宠物行业关注的热点问题,而且肥胖还可诱发糖尿病、高血压等疾病,严重危害动物健康,增加饲养成本[1-2]。研究表明,肠道与脂肪组织具有串扰现象,称为肠-脂肪组织轴[3]。肥胖与肠-脂肪组织轴关系密切,肠道黏膜屏障功能障碍导致脂多糖易位产生的代谢性内毒素血症是肥胖症最重要的启动因子之一[4-6]。因此,调节肠-脂肪组织轴有望成为肥胖防治的一种有效途径。

菊粉是一种聚合度(degree of polymerization, DP)为2～60的果糖聚合物,具有降血糖和血脂、调节肠道菌群及提高免疫等多种生理功能,已广泛应用于猪、牛及家禽等动物[7-9]。通常把DP≤10的称为低聚合度菊粉,DP≥23的称为高聚合度菊粉[10],不同聚合度的菊粉可产生不同的生理功能[11]。He等[12]研究发现,高聚合度菊粉可通过调节肠道黏膜屏障功能影响肠-胰腺轴缓解急性胰腺炎,而低聚合度菊粉无此作用。王琦[13]研究表明,菊粉可降低高脂饮食小鼠的体重,且高聚合度菊粉效果优于低聚合度菊粉。然而,高聚合度菊粉通过调节肠-脂肪组织轴改善肥胖症的作用还有待于研究。因此,本试验主要研究高聚合度菊粉对高脂饮食犬肥胖改善作用及其与肠-脂肪组织轴的关系,为高聚合度菊粉在犬抗肥胖功能性食品上的应用和开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

经江苏农牧科技职业学院动物福利与伦理审查委员会批准(编号NSF202108),40只泰迪型贵宾犬由本单位美容实验犬舍提供,雄性,3岁,体重5.5 kg左右,健康状况良好。实验动物使用许可证为SYXK(苏)2021-0037。

1.2 主要材料

高聚合度菊粉(Orafti® HP,聚合度≥23,纯度>99%)购于常州迪沙医药科技有限公司。

1.3 试验设计

选取40只泰迪型贵宾犬,随机等分为5组:正常饲粮组(CD组)、高脂饲粮组(HFD组)、低剂量高聚合度菊粉组(LHI组)、中剂量高聚合度菊粉组(MHI组)和高剂量高聚合度菊粉组(HHI组)。试验前各组均以正常饲粮进行2周适应性饲喂。然后,CD组饲喂正常饲粮,HFD组饲喂高脂饲粮,LHI组、MHI组和HHI组分别饲喂含1.0%、3.0%和5.0%高聚合度菊粉的高脂饲粮。试验期为12周。整个试验过程中,所有犬均单笼饲养,每天08:30及16:30各喂食1次,所有犬每天自由活动15 min左右。基础饲粮参考《犬营养标准》(NRC—2016)配制,各组饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮的组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.4 体重、采食量和体脂率的测定

试验前称量体重,然后每2周称重1次,按公式:

体重增加率=(测量体重-初始体重)/初始体重×100%,计算体重变化情况。按:采食量=给予饲粮-剩余饲粮,每周计算1次采食量,按:平均采食量=总采食量/总时间,计算平均采食量。试验结束后,用EchoMRI体成分分析仪(美国,EchoMRI LLC公司)测定体脂率。

1.5 血液生化检测

试验结束时,空腹经桡外侧静脉采集各组试验犬的血液,3 000 r·min-1离心10 min得到血清。当天用试剂盒测定血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和葡萄糖(Glu)含量,试剂盒购于北京百奥莱博科技有限公司。用ELISA试剂盒法(购于美国Biolegend公司)测定白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)、脂多糖(LPS)和D-乳酸含量。

1.6 口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

试验结束后,所有犬禁食12 h,然后按2.0 g·kg-1体重服用葡萄糖。在给药后0、30、60、90和120 min,通过血糖检测试剂盒测量桡侧静脉血液中的葡萄糖浓度。然后,以血糖浓度为纵坐标,时间为横坐标绘制曲线,并计算出曲线下面积(AUC)。

1.7 胰岛素耐量试验(ITT)

在OGTT试验结束后第3天,按0.5 U·kg-1体重肌肉注射胰岛素,在给药后0、30、60、90和120 min,通过血糖检测试剂盒测量桡侧静脉血液中的葡萄糖浓度。然后,以血糖浓度为纵坐标,时间为横坐标绘制曲线,并计算出曲线下面积(AUC)。

1.8 实时荧光PCR检测

试验结束后,分别取腹部皮下白色脂肪组织和结肠黏膜,用TRIzol法提取脂肪组织总RNA和结肠黏膜总RNA。然后合成cDNA并用于实时荧光PCR扩增。β-肌动蛋白(β-actin) 为内参基因,检测脂肪组织中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)的mRNA相对表达量以及空肠黏膜中闭锁蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的mRNA相对表达量。PCR扩增条件为:95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s,40个循环。目的基因引物由上海生工生物技术有限公司设计和合成,详见表2。目的基因 mRNA 的相对表达量用 2-ΔΔCt法计算。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequences for PCR

1.9 Western blot检测

用RIPA裂解液提取皮下脂肪组织总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,用5×上样缓冲液配平各蛋白样品,上样进行SDS-PAGE电泳2 h,PVDF膜转膜2 h,用5%脱脂牛奶室温封闭2 h。加Ⅰ抗IL-6(1∶2 000)、TNF-ɑ(1∶2 000)和GAPDH(1∶5 000),置于4 ℃摇床中孵育过夜,TBST洗膜3次,每次5 min。加辣根过氧化物酶标记Ⅱ抗(1∶5 000)室温下孵育1 h, TBST洗膜3次,每次5 min。化学发光成像仪中显影成像。以GAPDH为内参,采用Image J分析软件对各组条带的光密度值进行分析,试验重复3次,取平均值。所有抗体均购于美国Sigma公司。按上述方法,检测结肠黏膜中Occludin、ZO-1和MLCK表达。

1.10 数据处理

试验结果用“平均值±标准差”表示,两组间数据用SPSS 23.0软件t检验进行比较,采用Pearson方法进行相关性分析。P<0.05表示有显著性差异,P<0.01表示有极显著性差异。

2 结 果

2.1 高聚合度菊粉对高脂饮食犬体重、采食量和体脂率的影响

从图1a可知,各组犬体重呈增加趋势,HFD组体重从第2周开始显著高于CD组(P<0.05),MHI组和HHI组体重从第4周开始显著低于HFD组(P<0.05),LHI组体重从第8周开始显著低于HFD组(P<0.05)。从图1b可知,试验结束时,HFD组体重增加率显著高于CD组(P<0.05),约增加34%,各剂量高聚合度菊粉组的体重增加率显著低于HFD组(P<0.05)。各组间平均采食量无显著变化(图1c)。HFD组犬体脂率显著高于CD组,高聚合度菊粉以剂量依赖式降低高脂饮食犬的体脂率,与HFD组差异显著(P<0.05,图1d)。

a. 体重变化;b.体重增加率;c.平均采食量;d.体脂率。图中CD正常饲粮组,HFD为高脂饲粮组,LHI、MHL和HHI分别为低剂量、中剂量和高剂量高聚合度菊粉组,下图同。*表示与CD组比较P<0.05, #表示与HFD组比较P<0.05a. Body weight change; b. Body weight gain rate; c. Average feed intake; d. Body fat rate. In the figure, CD. Normal diet group; HFD. High fat diet group; LHI, MHL and HHI. Low-dose, medium-dose and high-dose high polymerization inulin groups, respectively. The same as below. * P<0.05 compared with CD group, and # P<0.05 compared with HFD group图1 高聚合度菊粉对高脂饮食犬体重、采食量和体脂率的影响Fig.1 Effects of inulin with high degree of polymerization on body weight, feed intake and body fat rate in dogs fed with high-fat diet

2.2 高聚合度菊粉对高脂饮食犬血清生化指标的影响

由表3可知,HFD组血中TG、TC和LDL-C的含量显著高于CD组,HDL-C显著低于CD组(P<0.05)。随着高聚合度菊粉剂量的增加,高脂饮食犬血中TG、TC和LDL-C的含量逐渐降低,HDL-C含量逐渐升高,且HHI组与HFD组有显著差异(P<0.05)。所有组之间的Glu含量无显著差异。

表3 血液生化指标的变化Table 3 Changes of blood biochemical indexes mmol·L-1

2.3 高聚合度菊粉对高脂饮食犬血糖代谢的影响

从图2a、图2b可以看出,各组犬口服给予葡萄糖后,血糖值呈显著增加趋势,在第30分钟达到最高值,随后血糖值呈逐渐降低趋势;与CD组相比,HFD组AUC显著增加,高脂饮食中添加低、中、高剂量高聚合度菊粉后,LHI组、MHI组和HHI组的AUC显著低于HFD组(P<0.05)。ITT结果显示(图2c、2d),各组犬肌肉注射胰岛素后,血糖值呈显著降低趋势,在第60 min 达到最低值,随后血糖值呈逐渐增加趋势;与CD组相比,HFD组AUC显著增加,高脂饮食中添加低、中、高剂量高聚合度菊粉后AUC呈降低趋势,HHI组的AUC显著低于HFD组(P<0.05)。

a. 口服葡萄糖耐量试验(OGTT)血糖变化;b. OGTT曲线下面积;c. 胰岛素耐量试验(ITT)血糖变化;d. ITT曲线下面积。*.P<0.05a. Changes of blood glucose in oral glucose tolerance test (OGTT); b. AUC of OGTT blood glucose curve; c. Changes of blood glucose in insulin tolerance test (ITT); d.AUC of ITT blood glucose curve. *. P<0.05 图2 高聚合度菊粉对高脂饮食犬血糖代谢的影响Fig.2 Effect of inulin with high degree of polymerization on blood glucose metabolism in dogs fed with high-fat diet

2.4 高聚合度菊粉对高脂饮食犬结肠黏膜屏障功能的影响

与CD组比较,HFD组血清中D-乳酸的含量显著升高(P<0.01);与HFD组比较,MHI组和HHI组D-乳酸显著降低(P<0.05,图3a)。从图3b可以看出,与CD组比较,HFD组结肠黏膜中Occludin、ZO-1的mRNA相对表达量显著下调;不同剂量高聚合度菊粉均可回调这些mRNA相对表达量,MHI组和HHI组Occludin和ZO-1的mRNA相对表达量均显著高于HFD组(P<0.05);HFD组结肠黏膜中MLCK的mRNA表达较CD组显著上调,而MHI组和HHI组MLCK的mRNA表达较HFD组显著下调。Western blot结果显示,与CD组比较,HFD组结肠黏膜中Occludin、ZO-1蛋白表达显著下调,MLCK蛋白表达显著上调;与HFD组比较,MHI组和HHI组Occludin、ZO-1蛋白表达显著上调,MLCK蛋白表达显著下调(图3c、3d)。

a. 血清中D-乳酸含量;b. 结肠黏膜中闭锁蛋白、闭锁小带蛋白-1和肌球蛋白轻链激酶的mRNA相对表达量;c～d. 结肠黏膜中闭锁蛋白、闭锁小带蛋白-1和肌球蛋白轻链肌酶的Western blot相对定量分析。*.P<0.05; **.P<0.01a. The content of D-lactic acid in serum; b. The relative mRNA expression of Occludin, Zonula occludens protein 1(ZO-1) and myosin light chain kinase(MLCK); c-d. The relative expression of occludin, ZO-1 and MLCK in colonic mucosa by Western blot.*.P<0.05; **.P<0.01图3 高聚合度菊粉对高脂饮食犬结肠黏膜屏障功能的影响Fig.3 Effect of inulin with high degree of polymerization on colonic mucosal barrier function in dogs fed with high-fat diet

2.5 高聚合度菊粉对高脂饮食犬血清及脂肪组织炎症因子表达的影响

由图4a、4b、4c 可知,与CD组比较,HFD组血清IL-6、TNF-ɑ和LPS含量显著升高(P<0.01);随着高聚合度菊粉剂量增加,高脂饮食犬血清IL-6、TNF-ɑ和LPS含量均呈下降趋势;与HFD组比较,MHI组TNF-ɑ和LPS含量显著降低(P<0.05),HHI组IL-6、TNF-ɑ和LPS含量显著降低(P<0.05或P<0.01)。高脂饮食犬血清LPS与IL-6、TNF-ɑ均呈正相关关系(r=0.663,P<0.001;r=0.695,P<0.001。图4d、e)。HFD组脂肪组织中IL-6、TNF-ɑ的mRNA相对表达量较CD组显著上调,但随着高聚合度菊粉剂量增加呈下调趋势,MHI组(P<0.05)和HHI组(P<0.01)均与HFD组有显著差异(图4f、4g)。Western blot结果显示,与CD组比较,HFD组脂肪组织中IL-6、TNF-ɑ蛋白相对表达量升高,与HFD组比较,MHI组和HHI组IL-6、TNF-ɑ蛋白相对表达量降低(P<0.05,图4h、4i)。

3 讨 论

肥胖是动物能量代谢稳态失调导致能量摄入超过消耗所引起的大量脂肪积聚于脂肪组织的一种代谢病,并且还可引发胰岛素抵抗,加剧糖脂代谢紊乱,使病情恶化[14-15]。利用高能高脂饮食构建动物肥胖症是研究肥胖发生机制以及寻求有效治疗方法的极为重要方式[16],田威龙等[17]利用高能高脂饮食成功建立猪的肥胖模型。本试验以贵宾犬为试验动物,给予高脂饲粮后,不仅体重、体脂率和血脂水平显著增加,还发生了葡萄糖耐量受损及胰岛素抵抗。本研究结果与之前一些研究结果相一致[18-19]。以上结果提示,本试验成功建立了高脂饲粮诱导的肥胖犬模型。给予高聚合度菊粉干预可降低高脂饮食犬的体重、体脂率及血脂水平,改善糖耐量受损和胰岛素抵抗。这些结果说明高聚合度菊粉对改善犬肥胖具有积极作用。

研究表明,白色脂肪组织(WAT)炎症是促进肥胖发展的重要因素。WAT中的脂肪细胞以及M1巨噬细胞可分泌大量的TNF-α及IL-6等促炎因子,这些促炎因子释放到循环系统,引起全身慢性低度炎症,进一步加剧代谢紊乱,加快肥胖及其相关代谢病的发展。Lu等[20]研究发现,LPS易位介导的TLR4/NF-κB通路可促进犬脂肪组织炎症和肥胖。而肠黏膜屏障功能障碍是LPS易位的重要前提。肠道黏膜屏障是由肠物理屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障4个部分组成的复杂结构[21]。紧密连接是肠物理屏障的重要组成部分,由多种肠道紧密连接蛋白组成[22]。紧密连接蛋白Occludin主要负责调控紧密连接的通透性[23],ZO-1调控细胞骨架形成[24],MLCK可调控这些蛋白表达[25]。研究表明,紧密连接蛋白表达水平降低是机体肠道屏障功能损伤的主要原因[26-27],高脂饮食可通过诱导肠上皮紧密连接蛋白的表达降低或分布异常引起肠黏膜屏障受损[28-29]。Kim等[30]发现高脂饮食可导致小鼠肠道中LPS易位进入血液,诱导脂肪组织和肝中TLR4及其下游产物IL-6和TNF-α的高表达。细胞试验也表明,脂肪细胞中LPS-TLR4信号通路激活诱导的慢性低度炎症与肥胖关系密切[31-32]。上述结果表明,肠-脂肪组织轴对话机能紊乱与肥胖有密切关系。本研究中,高脂饲粮组结肠黏膜中Occludin和ZO-1表达下调,血清LPS和D-乳酸水平升高,血清中IL-6和TNF-α水平升高,脂肪组织中IL-6和TNF-α的表达升高,给予高聚合度菊粉后,可逆转这些变化。这些结果说明高聚合度菊粉可以调节“肠黏膜屏障功能障碍-LPS易位-脂肪组织炎症”这一肠-脂肪组织轴机能紊乱。

4 结 论

综上,高聚合度菊粉可能通过改善“肠黏膜屏障功能-LPS易位-脂肪组织炎症”这一途径调节肠-脂肪组织轴,从而有效改善高脂饮食诱导犬的肥胖和血糖血脂代谢。