正交实验优化甘草多糖胶囊中总多糖含量测定

高嘉雯 朱旭江 姚世霞 牛钰婷

【摘 要】目的：建立甘草多糖胶囊中甘草多糖含量测定的方法。方法：以苯酚和硫酸的加入量、反应时间等为考察因素，采用正交实验设计优化苯酚-硫酸法测定甘草多糖含量的显色条件。并采用紫外分光光度法，以葡萄糖为对照品，于波长490 nm处测定甘草多糖吸光度，计算总多糖的含量。结果：甘草总多糖含量测定的最佳显色条件为苯酚用量1 mL，硫酸用量5 mL，放置时间30 min。甘草多糖在0.0621～0.1656 mg·mL-1浓度范围内线性关系良好，回归方程为y=0.0048x+0.0252，r=0.9995；精密度、稳定性、重现性良好；平均加样回收率为99.5%，RSD＝3.0％（n=9）。结论：该方法简便、准确、重复性好，可用于甘草多糖胶囊中总多糖的含量测定。

【关键词】甘草多糖胶囊；分光光度法；含量测定

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）16-0033-03

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.16.zgmzmjyyzz202316007

Orthogonal Experiment was Used to Optimize the Determination Method of Total

Polysaccharide in Glycyrrhiza Polysaccharide Capsules

GAO Jiawen1 ZHU Xujiang1，2* YAO Shixia2 NIU Yuting2

1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou 730070，China

Abstract： Objective To establish a method for the determination of total polysaccharides in Glycyrrhiza polysaccharide capsules.Methods Taking the amount of phenol and sulfuric acid，reaction time and so on as the investigation factors，the orthogonal experimental design was adopted to optimize the color development conditions for the determination of Glycyrrhiza polysaccharide content by phenol-sulfuric acid method.The absorbance of Glycyrrhiza polysaccharide was measured at 490nm by ultraviolet spectrophotometry，and the content of total polysaccharide was calculated.Results The best chromogenic conditions for the determination of total polysaccharide content in Glycyrrhiza uralensis Fisch were as follows： the dosage of phenol was 1 mL，the dosage of sulfuric acid was 5 mL，and the storage time was 30 min.The linear relationship of Glycyrrhiza polysaccharide is good in the concentration range of 0.0621～0.1656 mg·mL-1，and the regression equation is y=0.0048x+0.0252，r=0.9995;Good precision，stability and reproducibility; The average recovery rate is 99.5%，RSD=3.0%（n=9）.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the determination of total polysaccharides in Glycyrrhiza polysaccharide capsules.

Key words：Glycyrrhiza Polysaccharide Capsules; Spectrophotometry; Content Determination

甘草多糖膠囊系经水提醇沉法提取甘草中的多糖，加辅料制成的胶囊剂，为甘肃省中医院的院内制剂，临床用于提高免疫力［1-2］。该制剂的质量标准中采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS），单点外标法测定甘草多糖的含量，试验时发现操作过程复杂，试剂配制耗时，且辅料存在干扰，导致结果重现性较差。常用的多糖测定方法有：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法等［3-5］。其中，苯酚-硫酸法操作简便，测定快速，较为常用［6-7］。许多研究［8-10］发现，苯酚-硫酸法在测定结果的准确度和稳定性上均优于蒽酮-硫酸法。有研究［11-12］发现，在同质量浓度下，对比葡萄糖对照品溶液吸光度，苯酚-硫酸法的吸光度大于蒽酮-硫酸法和DNS法，表明苯酚硫酸法的测定结果更灵敏。因此，通过研究，建立了苯酚-硫酸比色法测定甘草多糖胶囊的含量，并通过正交实验设计优化显色条件，方法简便准确，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Lambda365紫外可见分光光度计（PerkinElmer公司）；MS205DU十万分之一天平（瑞士梅特勒公司）；ME204电子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；漩涡混合器（IKA VORTEX2）。

1.2 试药 甘草多糖胶囊（批号分别为：200402、200403、200301，甘肃省中医院提供）；D-无水葡萄糖（批号：110833-201707，含量99.9%，中国食品药品检定研究院）蒽酮、苯酚、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠、硫酸，均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取D-无水葡萄糖对照品103.49 mg，置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取储备液5 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取甘草多糖胶囊内容物适量，混匀，研细，精密称取0.1 g，置250 mL量瓶中，加水200 mL，旋涡振荡器混合5 min，超声（功率500 W，频率40 kHz）处理30 min，放冷至室温，加水至刻度，摇匀，取适量，过滤，精密量取滤液5 mL，置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 最大吸收波长的测定 精密吸取0.4 mL“2.1.1”项下对照品溶液，置刻度试管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，振荡摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，立即摇匀，冷却至室温。以相应试剂为空白，在400～700 nm扫描光谱。由图1结果可知对照品溶液在490 nm处有最大吸收，故选择490 nm为测定波长。

2.3 正交实验设计优化显色条件 通过前期实验发现，苯酚和硫酸的加入量、反应时间均对结果有较大影响，因此，采用L9（34）正交试验设计，以吸收度为考察指标优选最佳显色条件，并运用SPSS 27.0统计软件对试验结果进行方差分析。正交试验因素与水平见表1，正交试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

由表2直观分析可知，各因素对综合评分影响的顺序为B＞A＞C；由表3的方差分析可知，浓硫酸用量对显色具有显著意义。综合直观分析和方差分析结果，确定总多糖含量测定条件的最佳工艺条件为A2B1C3，即苯酚用量为1 mL，硫酸用量为5 mL，放置时间为30 min。经对同一批樣品制备3批供试品溶液进行验证，结果RSD为3.0%（n=3），显色条件方法可行。

2.4 标准曲线的绘制 精密吸取葡萄糖对照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，分别置具塞刻度试管中，加水至1 mL，摇匀，加入5 %苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入硫酸5 mL，摇匀，放置30 min，加水至10 mL，冰浴冷却，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（2020版中国药典通则0101），在490 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为方程为：y=0.0048x+0.0252，r=0.9995，表明葡萄糖在0.0621～0.1656 mg·mL-1内线性关系良好。

2.5 专属性考察 按处方比例及制备工艺，制成不含甘草多糖的阴性样品，按“2.1.2”制成供试品溶液，测定吸收度。结果吸收度小于0.001，表明辅料不干扰实验，有较好的专属性。

2.6 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下葡萄糖对照品溶液0.4 mL，按“2.4”项下方法，重复测定吸光度6次，结果6次吸光度的RSD=0.06%（n=6），表明精密度较好。

2.7 重复性试验 取甘草多糖胶囊（批号：200402）粉末约0.1 g，精密称定，平行6份，按“2.1.2”制成供试品溶液，按照“2.4”项下方法测定其吸光度A，用标准曲线计算供试品溶液中葡萄糖的含量（mg/g）。结果平均含量为345.98 mg/g，RSD=1.88 %（n=6）。

2.8 稳定性试验 取同一批号样品（批号：200402），精密称取0.1 g，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按照“2.4”项下方法测定其吸光度，每间隔 5 min测定1次，共测定6次。结果平均吸光光度为0.3864，RSD值为1.93 %（n=6）。表明样品甘草多糖测定在30 min内基本稳定。

2.9 加样回收试验 取已知含量的甘草多糖胶囊（批号：200402）9份，每份0.05 g，精密称定，分别精密加入其样品多糖含量的50 %、100 %、150 %的对照品溶液，每个比例加3份，按“2.1.2”制成供试品溶液。分别精密移取 1 mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，测定平均加样回收率为99.5%，RSD = 3.0%（n=9），表明回收率良好。结果见表4。

2.10 样品的含量 测定取3批甘草多糖胶囊各0.1 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下方法测定吸光度，计算其中多糖含量。结果见表5。

3 讨论

苯酚-硫酸法是利用多糖在浓硫酸作用脱水生成糠醛衍生物，糠醛与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定［13］。本试验在单因素试验基础上，建立正交试验设计，考察了苯酚、浓硫酸用量和反应时间3个因素对甘草多糖含量测定的影响。最终确显色条件为即加入苯酚1 mL，硫酸5 mL，放置时间为30 min。该方法操作简便，试剂易得，能快速准确测定甘草多糖的含量。

此外，分别选用超声法、回流法、水浴保温法以及直接溶解法等4种方式作为样品中多糖的提取方法制备供试品溶液，在490 nm处测定吸光度值，结果显示，超声法测定结果较高，且操作简便，故选用其作为样品的制备方法。

通过方法学考察，验证了本方法精密度高，重复性好，稳定性和准确度均较好。采用苯酚-硫酸法测定甘草多糖胶囊中多糖的含量，方法可行，操作简单，可用于甘草多糖胶囊的质量控制，对指导临床用药及制订制剂质量标准有一定参考价值。

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