2022年浙江省PRRSV流行毒株ORF5基因序列遗传进化分析

姚春雷，王雅婷，安慧婷，张传亮，赵灵燕，徐 辉，谢荣辉

（1.海盐县畜牧兽医服务中心，浙江海盐 314300；2.浙江省动物疫病预防控制中心，浙江杭州 311199）

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可引起猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），导致的临床症状主要为发热，呼吸困难，厌食，怀孕母猪流产，产死胎、弱仔、木乃伊胎等。PRRSV长期广泛流行于欧洲、亚洲和北美等地区的养猪国家，给养猪业造成了巨大经济损失[1]。

PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，其基因组为单股正链RNA，大小约15 kb，具有至少10个开放型阅读框（ORF），共编码14个非结构蛋白和8个结构蛋白[2]。根据PRRSV基因组的遗传变异特性，可将PRRSV分为欧洲型（基因I型）和美洲型（基因II型），2种基因型毒株之间的核苷酸同源性为55%～70%，抗原性差异大，免疫学上无交叉保护，但引起的临床症状相似[3]。根据ORF5基因，美洲型PRRSV可进一步分为谱系1～9[4-5]。目前在我国流行的美洲型PRRSV有4个谱系，分别为谱系1、3、5和8[6-10]；同时欧洲型PRRSV也在我国不同地区被检出[11-14]。为了更好地掌握当前浙江省PRRSV流行毒株的遗传变异状况，本研究收集了2022年浙江省各地的PRRSV阳性组织病料进行了ORF5基因序列和氨基酸位点分析。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit和DL 2 000 DNA Marker，购自Takara公司；病毒核酸提取试剂盒，购自Roche公司。

1.2 组织样品采集和处理

经荧光定量PCR鉴定的37份PRRSV阳性组织病料，2022年采集自杭州、嘉兴、湖州、绍兴、台州、温州、衢州和宁波等地无害化处理场和屠宰场。将采集的组织病料剪碎，加适量的无菌PBS缓冲液进行研磨，反复冻融3次后，10 000 r/min离心5 min，取上清备用。

1.3 引物设计与合成

参考文献[15]中的PRRSV ORF5引物序列，合成扩增引物。扩增引物，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 ORF5基因扩增与测序

按照病毒核酸提取试剂盒说明书，提取PRRSV阳性组织病料中的病毒核酸；以PRRSV RNA为模板，以文献[15]中的反应体系和反应条件扩增ORF5基因片段，扩增产物直接送上海生工生物工程有限公司测序。

1.5 ORF5基因序列和抗原位点分析

应用DNAstar和Mega 7生物软件，分析浙江省PRRSV阳性病料感染毒株与美洲型PRRSV参考毒株（表1）ORF5基因核苷酸和氨基酸同源性、遗传进化特征和抗原位点。

表1 参考毒株信息

2 结果

2.1 同源性比较

结果（图1）显示：本研究的37份PRRSV阳性样品的ORF5基因均由603个碱基组成，编码200个氨基酸，属于美洲型，各PRRSV阳性样品间的ORF5基因核苷酸和编码氨基酸同源性分别为82.1%～100%和81.1%～100%。37份PRRSV阳性样品的ORF5基因与高致病性PRRSV毒株JXA1、经典PRRSV毒株VR2332、国内早期PRRSV毒株CH1-a、NADC30类毒株、NADC34类毒株和新型PRRSV毒株QYYZ的核苷酸同源性分别为84.1%～98.7%、83.9%～99.7%、85.2%～95.0%、85.3%～94.0%、86.4%～96.2%和82.8%～85.1%，编码氨基酸同源性分别为83.6%～99.5%、82.6%～99.0%、84.1%～93.5%、83.1%～94.5%、85.6%～95.5%和81.1%～86.6%；与疫苗株JXA1-P80的核苷酸和编码氨基酸同源性分别为83.6%～99.0%和83.1%～99.0%，与疫苗株CH1-R的同源性分别为84.8%～94.2%和82.6%～92.0%，与疫苗株TJM的同源性分别为84.2%～99.0%和84.1%～98.5%。

图1（续）

2.2 系统进化分析

根据ORF5基因核苷酸序列，采用Mega软件进行比对并建立系统进化树。结果（图2）显示：37份PRRSV阳性样品的感染毒株分属3个谱系，其中23份样品的毒株属于谱系1，与NADC30类和NADC34类同处于一簇；7份样品的毒株属于谱系5，与R98和VR-2332等经典毒株处于同一簇；7份样品的毒株属于谱系8，与JXA1毒株处于同一簇。结果表明，2022年浙江省流行的毒株以谱系1中NADC30类和NADC34类毒株为主，且同时存在3种谱系毒株的流行。

图2 基于ORF5基因的PRRSV遗传进化树

2.3 氨基酸分析

结果（图3）显示：本研究中的6份PRRSV阳性样品的感染毒株具有强毒株特性，其GP5蛋白第13和第151位氨基酸均为R；其余样品在此位置只有1个R或无R，无强毒株特性。37份PRRSV阳性样品感染毒株的GP5蛋白氨基酸变异主要集中于信号肽、2个高变区、B细胞抗原位点和2个T细胞抗原位点附近，而第44和第51位糖基化位点的氨基酸均未发生变化，但部分参考毒株在第32、33、34和35位糖基化位点却发生了突变。有些位点的氨基酸具有谱系特异性，谱系1毒株GP5蛋白第47和58位氨基酸分别为I和N/S，谱系8毒株第9、39和94位氨基酸分别为C、I和A，谱系5毒株GP5蛋白第185位的氨基酸为V。与疫苗株CH1-R相比，36份PRRSV阳性样品感染毒株的GP5蛋白只在中和抗原表位第39位氨基酸存在差异；与疫苗株JXA1-P80和TJM相比，除了谱系8外，谱系1和谱系5均在中和抗原表位第39位氨基酸存在着差异。

图3 PRRSV GP5蛋白序列比对分析结果

3 讨论

PRRSV易发生突变和重组，新毒株不断出现，导致不同时期流行的毒株也不相同。研究[16-19]表明：1996—2006年我国主要流行以CH1-a和VR-2332为代表的经典毒株，2006—2017年我国主要流行以JXA1为代表的高致病性PRRSV毒株；2014年以来，NADC30类毒株开始流行，并已成为当前主要流行毒株，此外NADC34毒株也开始在我国流行[19-20]。为更好地掌握浙江省当前PPRSV流行变异状况，本研究对浙江省各地的PRRSV阳性组织病料进行了ORF5基因扩增和测序分析，发现浙江省2022年流行的PRRSV优势毒株为谱系1毒株，同时伴有谱系5和谱系8毒株的流行，但未发现以QYYZ为代表的谱系3毒株，这与PRRSV在我国存在着多种谱系的报道相一致[6，10，21-22]。由于本研究测序数量有限，是否有欧洲株或其他谱系毒株有待于进一步研究。因此，加强PRRSV监测和流行毒株监控，对PRRS防控具有重要意义。

研究[23-24]表明，PRRSV的GP5蛋白与病毒的复制、毒力以及中和作用相关，部分氨基酸突变将影响病毒毒力和PRRSV疫苗株的交叉保护性。GP5蛋白的第37～45位氨基酸是PRRSV的主要中和抗原位点，其中第38、42、43和44位氨基酸是病毒中和表位的识别位点，第39、40、41位氨基酸是病毒中和表位的结合位点。因此，第39、40、41位氨基酸突变可能干扰毒株与中和抗体的结合[15，25]。本研究发现，与疫苗株JXA1 P80和TJM相比，谱系 5和谱系1毒株在GP5中和表位的第39位发生了突变（I→L），而谱系8毒株在该表位未发生突变。与疫苗株CH1-R相比，谱系1、5和8毒株在GP5中和表位第39位均发生了突变（F→L/I）。这可能导致疫苗株中和抗体保护率下降，进而引起病毒免疫逃逸。

4 结论

研究发现：浙江省存在多个谱系的美洲型PRRSV毒株流行，其中谱系1（NADC30类和NADC34类）为优势流行毒株，部分毒株具有高致病性特征；不同流行毒株间存在一定的基因变异，与疫苗株相比，流行毒株的中和抗原表位存在氨基酸突变，可能会导致疫苗保护力下降。因此，需要继续加强PRRS监测，及时掌握PRRSV流行毒株的遗传变异状况，从而为PRRS防控提供参考。