知柏地黄汤抗HSV-2的作用机制

徐婷玉,匡琳,石佳灵,张佳敏,吴扬帆

2型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 2,HSV-2)属于人类疱疹病毒家族中的α疱疹病毒,是具有囊膜的双链DNA病毒［1］。HSV-2是引起生殖器疱疹的主要病原体,主要通过性接触传播引起反复发作、难以治愈的生殖器感染［2-3］,研究表明感染HSV-2的患者感染人免疫缺陷病毒(HIV)的危险性高于普通人,孕妇感染HSV-2会引起胎儿感染,严重者会导致胎儿持久性神经损伤以及胎儿死亡［4-6］。由于其反复发作以及一系列严重的并发症,防治单纯疱疹病毒感染依然是当今世界最重要的公共健康问题之一。近年来中医药抗病毒治疗广泛应用于临床常见的病毒感染性疾病,中草药抗HSV-2有一定的优势。本课题组前期在临床上运用知柏地黄汤治疗生殖器疱疹,疗效确切,有效的降低了复发率［7］。但是知柏地黄汤治疗生殖器疱疹的作用机制尚不清楚,相关实验研究较少,未能深入研究知柏地黄汤抗HSV-2的作用机制。本研究拟通过网络药理学研究方法联合蛋白质组学技术探讨知柏地黄汤抗HSV-2的作用机制,为后续的深入研究提供方向与依据。

1 材料与方法

1.1知柏地黄汤抗HSV-2的网络药理学研究

1.1.1知柏地黄汤活性成分及作用靶点获取 通过TCMSP数据库［8］(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索知柏地黄汤各药物的活性成分和作用靶点,并设置筛选标准为口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及类药性(drug likeness,DL)≥0.18,利用Uniprot数据库［9］(https://www.uniprot.org/)对获取的靶点进行基因名校正。

1.1.2知柏地黄汤成分-靶点网络图构建 将获取的知柏地黄汤活性成分及作用靶点导入Cytoscape3.9.1软件［10］,构建药物成分-靶点网络图,利用内置插件Cyto Hubba［11］对网络图进行分析。

1.1.3HSV-2相关靶点获取 以“herpes simplex virus 2”为关键词在GeneCards数据库［12］(https://www.genecards.org/)和OMIM数据库［13］(https://www.omim.org/)中检索HSV-2相关靶点,并通过Venny2.1在线平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)获取药物成分靶点与疾病靶点的交集靶点。

1.1.4知柏地黄汤抗HSV-2的PPI网络构建 将交集靶点上传至String数据库［14］(https://string-db.org/),获取PPI网络信息,再利用Cytoscape3.9.1软件对网络信息进行可视化,结合内置插件Cyto Hubba分析并筛选核心靶点。

1.1.5交集靶点富集分析 通过DAVID数据库［15］(https://david.ncifcrf.gov/)对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析,以P<0.05为阈值筛选符合条件的结果,利用微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化处理。

1.1.6运用分子对接预测知柏地黄汤有效成分与核心靶点的关系 通过分子对接技术将1.1.1中得到的主要有效成分与1.1.4中得到的核心靶点进行相互作用的可靠性验证。

1.2知柏地黄汤对HSV-2感染神经元细胞的蛋白质组学研究

1.2.1实验动物 SPF级SD大鼠20只,雌雄各半,8周龄,体重为(200±20)g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司［许可证号:SCKX(湘)2019-0004］。所有大鼠饲养于屏障环境内,12 h昼夜明暗交替,温度22～26 ℃,湿度40%～60%,自由进食及饮水。动物实验操作通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号:LLBH-202111250002)。

1.2.2实验药物及试剂 知柏地黄汤配方颗粒:知母10 g、黄柏10 g、山茱萸15 g、山药15 g、牡丹皮10 g、泽泻10 g、茯苓10 g、熟地黄20 g(深圳华润三九股份有限公司提供)。

DMEM高糖培养基(武汉普诺赛公司,货号PM150210),BCA蛋白定量试剂盒(武汉伊莱瑞特公司,货号E-CK-A362),甲酸(美国Thermo Fisher公司,货号A117),乙腈(德国Merck公司,货号1000304008)。

1.2.3实验细胞及病毒株 人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y),购于武汉普诺赛,货号为CL-028。HSV-2 333株,购于武汉病毒所,TCID50为4.5,保存于湖南中医药大学中西医结合病原生物实验室。本实验中所有病毒操作均在BSL-2实验室中完成。

1.2.4实验仪器 二级生物安全柜、二氧化碳培养箱、高速冷冻离心机、EasynLC色谱系统、QExactive HF-X质谱仪(美国Thermo Fisher公司),倒置荧光显微镜(德国CarelZeiss公司),立式自动压力蒸汽灭菌器(厦门致微仪器公司)。

1.2.5含药血清制备 20只大鼠适应性喂养3 d后,按照随机数字表法分为空白对照组与知柏地黄汤组,每组10只。根据人与大鼠体表面积换算的等效剂量比值计算出大鼠给药剂量［16］。知柏地黄汤组予以9 g/(kg·d)的剂量灌胃,空白对照组以等体积的生理盐水灌胃,2次/d,连续灌胃7 d。末次灌胃24 h后,用40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血,室温静置2 h后,3 000 r/min,离心15 min收集上层血清,56 ℃灭活30 min,经0.22 μm滤膜过滤后分装保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.6构建HSV-2感染的SH-SY5Y细胞模型 SH-SY5Y细胞密度达80%以上时,胰酶消化,重悬细胞后接种于6孔板中,设置正常对照组(BCG组)、病毒模型组(MCG组)和知柏地黄汤组(ZDD组)。首先各组以10%FBS的DMEM高糖培养基进行培养,待细胞贴壁且密度达70%以上时,MCG组和ZDD组加入100TCID50的病毒液进行干预,CO2培养箱中孵育2 h后,BCG组与MCG组更换10%空白血清的培养基,ZDD组更换为10%知柏地黄汤含药血清的培养基,培养箱中培养24 h后收集相应样本。

1.2.7蛋白质组学研究 取干预后的SH-SY5Y细胞样品,加入SDT裂解液,沸水浴15 min。14 000 g离心15 min,取上清液,BCA法测定蛋白质浓度。蛋白样品经丙酮沉淀、重溶、还原、烷基化、酶解、去除SDC及多肽脱盐处理得到肽段。每份样品采用纳升流速EasynLC色谱系统进行分离,经色谱分离后用QExactive HF-X质谱仪进行质谱分析。

1.3统计学处理 质谱数据采用MaxQuant软件(v1.6.17.0)进行数据库搜索,数据库为uniprot_homo_20221024_20402_9606_swiss_prot,采用LFQ(LabelFree Quantitation)算法进行定量分析。然后利用t检验方法计算P鉴定差异蛋白,以表达差异倍数大于1.5倍且P≤0.05为筛选条件;再通过Fisher精确检验进行差异蛋白GO及KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1网络药理学结果

2.1.1知柏地黄汤活性成分及靶点筛选结果 以OB≥30%及DL≥0.18为筛选标准,共获得126个活性成分,其中知母15个,黄柏37个,熟地黄2个,山药16个,山茱萸20个,牡丹皮11个,泽泻10个,茯苓15个。剔除无对应靶点信息的活性成分并去重,最终得到69个活性成分。对知柏地黄汤活性成分靶点信息预测结果整合去除重复值后得到213个作用靶点。

2.1.2知柏地黄汤药物成分-靶点网络图构建 利用Cyto Hubba插件计算各节点的Degree值,根据Degree值筛选出排名前10的成分,分别为槲皮素、山奈酚、豆甾醇等,见表1。将得到的药物活性成分和作用靶点导入Cytoscape3.9.1中,构建知柏地黄汤成分-靶点网络图,网络中共291个节点,1 263条边。

表1 知柏地黄汤Degree值前10的活性成分

2.1.3HSV-2相关靶点筛选结果 以“herpes simplex virus 2”为关键词分别在GeneCards和OMIM数据库进行检索,将得到的结果合并删除重复值后,最终获得HSV-2疾病靶点282个。将其与药物成分靶点上传至Venny2.1在线平台,取交集后共获得37个交集靶点,韦恩图见图1。获得的交集靶点即为知柏地黄汤抗HSV-2的潜在作用靶点。

图1 知柏地黄汤与HSV-2靶点韦恩图

2.1.4知柏地黄汤抗HSV-2的PPI网络构建 将37个交集靶点上传至String数据库,置信度选择最高置信度0.9,隐藏无关靶点,得到PPI网络信息。利用Cytoscape3.9.1软件对导出的tsv文件进行可视化处理,得到PPI网络图(图2),结合Cyto Hubba插件进行分析,根据Degree值筛选出排名前10的核心靶点,主要有RELA、IL-6、TNF、IL-10等,见图3,表2。

图2 知柏地黄汤抗HSV-2潜在靶点PPI网络

图3 知柏地黄汤抗HSV-2核心靶点PPI网络

表2 知柏地黄汤抗HSV-2核心靶点

2.1.5GO功能分析结果 通过David数据库对37个交集靶点进行GO基因功能分析,共得到GO功能富集结果479个,包括399个生物过程,27个细胞组分,53个分子功能,涉及144条KEGG通路。对于GO分析中BP、CC和MF中排名前10的条目绘制富集条形图(图4)。在GO富集分析结果中,知柏地黄汤抗HSV-2的生物过程包括基因表达的正调节、细胞凋亡过程、炎症反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正向调控、细胞凋亡过程、DNA模板转录的正调节等;细胞组分中包括细胞外间隙、胞核、胞质、胞浆、线粒体外膜等;分子功能主要富集于酶结合、细胞因子活性、蛋白质结合、蛋白激酶结合、激酶活化、DNA结合等。

图4 知柏地黄汤抗HSV-2潜在靶点GO分析

2.1.6KEGG富集通路分析结果 KEGG富集通路分析共得到144条信号通路,其中主要有IL-17信号通路、Toll受体信号通路、TNF信号通路等通路,根据P值筛选出前30条通路绘制KEGG富集图(图5)。在30条通路中发现部分与病毒感染有关的通路,分别为甲型流感、人巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、丙型肝炎等通路,说明知柏地黄汤可能通过相关信号通路途径发挥抗病毒作用。

图5 KEGG富集分析柱状图

2.1.7知柏地黄汤主要成分与核心靶点的分子对接结果 选取知柏地黄汤中3个主要有效成分槲皮素、山柰酚、豆甾醇与3个关键靶点IL-10、 IL-6、TNF进行分子对接。结果表明主要有效成分和靶点之间具有较好的结合性。见表3,图6。

图6 槲皮素与IL-10、IL-6、TNF分子对接示意图

表3 知柏地黄汤主要有效成分与核心靶点的分子对接结果 (kcal/mol)

2.2蛋白质组学结果

2.2.1蛋白/ 多肽统计 本研究共鉴定到3 960个蛋白(groups),28 434 条多肽,见图7。本实验中的质谱数据采集自Q Exactive HF-X高分辨率质谱仪,能够获得高质量的MS2图谱,然后使用Andromeda对MS图谱数据进行分析,最终获得每张MS2图谱的得分,即肽段离子得分(Ion Score)。从图8中可以看出,大多数肽段得分在60分以上,每一套Label-free数据在定性分析工作中均使用Peptide FDR≤0.01和Protein FDR≤0.01作为筛选标准,结合所得的优秀肽段得分分布情况,进一步说明实验数据质量较高。

图7 蛋白质鉴定结果统计图

图8 肽段离子得分分布图

2.2.2差异蛋白的筛选与表达分析 共鉴定出3 960个蛋白,病毒模型组(MCG组)与正常对照组(BCG组)相比,有688个上调蛋白,641个下调蛋白;知柏地黄汤组(ZDD组)与MCG组相比,有569个上调蛋白,619个下调蛋白,见图9。比较各组显著表达差异蛋白,其中ILF3、MAP1B、SERBP1等差异蛋白在MCG组呈现下调,在ZDD组呈现上调,而ADAM10、ITGAV、CD63等差异蛋白在MCG组呈现上调,在ZDD组呈现下调。说明这部蛋白可能是知柏地黄汤抗HSV-2的核心蛋白,后续还需通过实验进行进一步认证。

Note:Points in the figure are upregulated proteins in blue, downregulated proteins in cyan, and no difference in gray and black.

2.2.3差异蛋白GO 功能富集分析 采用 Blast2Go(https://www.blast2go.com/)软件对所有差异表达蛋白质进行GO功能注释,通过Fisher精确检验来发现差异表达蛋白的显著性的富集趋势(P<0.05)。结果表明这些蛋白主要参与了生物进程、细胞组成和分子功能的作用,潜在作用靶点主要集中在内质网膜、胞外区和细胞膜。知柏地黄汤通过影响细胞mRNA的稳定性、ATP的合成等途径干预HSV-2病毒在细胞内的复制,见图10。

Note:The ordinate represents the GO function name, the horizontal axis value is the significance P value-Log10 converted value, the color indicates the different GO function classification, and the number on the column represents the rich factor value.

2.2.4差异蛋白的KEGG 富集分析 对所有显著差异蛋白纳入KEGG 数据库进行检索,找出有显著关系的KEGG 通路,结果显示知柏地黄汤所涉及的通路主要有Toll、IL-17、P13K-Akt信号通路等,见图11。

Note:The ordinate indicates the KEGG pathway name, the abscissa indicates the rich factor value, the circle color represents the converted value, the blue color indicates the smaller P value, and the circle size indicates the number of differential proteins included in the pathway.

3 讨论

生殖器疱疹属于中医“阴疮”、“阴疳”等范畴,主要由于正气不足,触染湿热毒邪而发病,而湿热久蕴,耗气伤阴,阴虚邪恋,病情反复发作［17］。知柏地黄汤最早见于《医宗金鉴》,由六味地黄丸化裁而来,主要由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓、黄柏、知母八味中药组成,主要功效为滋阴降火,临床上用于治疗阴虚邪恋,阴虚火旺证。前期临床上运用知柏地黄汤治疗复发性生殖器疱疹取得了一定的疗效［7］。

本研究网络药理学结果显示,槲皮素、山奈酚、豆甾醇等可能为知柏地黄汤抗HSV-2的主要活性成分。槲皮素是一种天然黄酮类化合物,现代药理学研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗病毒以及光谱抗菌性等药理作用［18-20］。许玲芬等［21］发现槲皮素可以通过TLR4-NF-κB信号通路发挥抗炎、抗病毒的作用。山奈酚是一种黄酮化合物,现代药理学研究表明其具有镇痛、抗炎、抗病毒、抗氧化等药理作用［22］。豆甾醇属于一种植物性甾醇,具有较强的生物活性,具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用,其对过敏性皮肤病也有一定的药理作用［23-24］。

根据PPI网络及拓扑分析,筛选出较为重要的核心靶点,主要有RELA、IL-6、TNF、IL-10等。RELA通过可以通过抑制NF-κB和SP1的作用来阻断HSV-1病毒的转录［25］。肿瘤坏死因子、白介素等属于炎症细胞因子,其表达的异常一定程度上反映了机体免疫功能状况。网络药理学结果一定程度上说明知柏地黄汤抗HSV-2的核心靶点蛋白通过调节机体炎症反应以及免疫反应发挥抗病毒作用。GO与KEGG富集分析结果表明,RELA、IL-6、TNF、IL-10等靶点,可能通过参与调控IL信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路等多种信号通路。其中Toll样受体(TLRs)是一种模式识别受体,主要是识别病原体以及诱导先天免疫应答,在免疫系统发育和维持中起着重要作用［26］。本课题组前期研究表明了Toll样受体通路在HSV-2感染方面有重要作用［27］。

本研究通过蛋白质组学结果发现与病毒模型组相比,知柏地黄汤组中有569个蛋白上调,619个蛋白下调,共1 188个差异蛋白,其中ILF3、DDX1、CD63、ITGAV、HLA-C等差异表达显著。查阅相关文献发现,白介素增强因子(ILF3)在抗病毒感染方面发挥重要作用,在病毒感染后,ILF3在细胞质中积累并参与抗病毒天然免疫［28］。蛋白质组学结果显示,知柏地黄汤组ILF3上调,表明知柏地黄汤可能通过调节ILF3来发挥抗HSV-2作用。整合素α-V(ITGAV)是多种蛋白的受体,研究发现α-Vβ6和α-Vβ8作为HSV-1进入宿主细胞的受体,以高亲和力结合gH/gL,从而影响了HSV-2的进入途径［29］。蛋白质组学结果显示知柏地黄汤组ITGAV下调,说明知柏地黄汤可能通过调节ITGAV而发挥抗HSV-2的作用。

综上所述,本研究通过网络药理学和蛋白质组学的研究方法筛选出知柏地黄汤抗HSV-2的核心成分与核心靶点,知柏地黄汤可能通过槲皮素、山奈酚、豆甾醇等核心成分,作用于RELA、IL-6、TNF、IL-10等靶点,参与调控IL、Toll样受体、TNF等信号通路干预HSV-2的复制,体现了中药复方多成分-多靶点-多通路协同作用的特点。但知柏地黄汤的核心有效成分是如何通过主要的信号通路抑制生殖器疱疹复发的机制尚不清楚,有待后续深入研究及实验验证,为该方的临床应用提供的理论依据。