巨噬细胞在局限性硬皮病和系统性硬化症皮损中的极化状态

王芳,李心欣,李曼,2,丁晓岚,徐前喜,杜娟

局限性硬皮病(localized scleroderma,LS)和系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)的患者皮损均出现不同程度纤维硬化,组织病理均表现为早期混合炎症细胞浸润,晚期真皮大量胶原沉积和附属器减少［1-2］。近年来,巨噬细胞在组织纤维化和创伤愈合中的作用逐渐受到关注［3］。巨噬细胞是固有免疫中的重要调节者,激活后可极化为M1型或M2型,两种细胞亚型在炎症活动、创伤愈合以及组织纤维化的不同阶段各司其职［4］。M1型细胞以促进炎症、清除病原体和细胞,促进纤维溶解为主;M2型细胞则倾向抑制炎症、促纤维化和血管增生等作用［3, 5］。目前,国内尚无针对这一组硬化性皮肤疾病皮损中巨噬细胞极化状态的相关研究,而其极化与皮损硬化程度、患者临床病程和其他临床指标的关联性尚需探讨。因此,本研究收集LS和SSc患者的皮损,观察巨噬细胞的极化状态及其与疾病的相关性,探讨巨噬细胞极化在LS和SSc皮肤纤维化中的作用。

1 资料与方法

1.1研究对象 收集2018年1月—2020年9月就诊于本科的局限性硬皮病和系统性硬化患者病例并进行回顾性研究,包括:局限性硬皮病24例和系统性硬化18例,同时收集健康人对照10例。患者的病史、临床表现及组织病理检查均符合相应疾病诊断标准:LS参见2016年欧洲或2018年日本［6］局限性硬皮病诊断标准;SSc参见2013年美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)联合提出的诊断标准［7］;皮损活检前4周内未进行任何口服糖皮质激素、免疫抑制剂或外用药治疗,取材部位为活动期边缘,同时完整记录患者病情、皮损部位和相关血清学检查(ANA和Scl-70)结果。对照组选取整形或外伤手术需切取的健康皮肤,临床中无自身免疫或其他疾病,无糖皮质激素、免疫抑制剂或外用药使用史。实验组与对照组在性别、年龄等方面相符,具有可比性。本实验经过北京大学人民医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂 免疫组化CD68抗体购于北京中杉金桥、iNOS抗体购于美国Abcam公司、CD163抗体购于美国徕卡公司,Masson三染色试剂盒购于瑞士Roche公司,自身抗体ANA和Scl-70均由北京大学人民医院检验科提供检测。

1.3实验方法和步骤 取皮损/皮肤后经4%甲醛溶液固定,石蜡包埋,连续切取4 μm切片,脱蜡和暴露抗原处理,严格按照免疫组织化学和Masson三染色试剂盒实验步骤进行,设立相应阳性、阴性参照。总巨噬细胞、M1亚型和M2亚型分别用CD68、iNOS和CD163标记,用Masson三染色法行胶原染色并测定胶原容积分数(CVF)。

1.4图像分析 将免疫组织化学和特殊染色切片用显微镜(美国Leica)高倍镜头下(400×)采集图像,对每个标本目标区域随机选取不重叠的3～5处视野,在Image J 1.53图像系统辅助下分别测算LS组、SSc组和对照组标本组织真皮区域单位面积内CD68、CD163、iNOS的单位面积内细胞阳性数(cells/HP)和胶原容积百分比(%)。

2 结果

2.1患者临床资料 LS组、SSc组和对照组患者的年龄、性别、病程、自身抗体谱ANA和Scl-70阳性率分别如表1所示,各组患者年龄具有可比性(F=1.09,P=0.35)。LS组中仅有1例患者表达ANA(1∶80斑点型),Scl-70均为阴性;而SSc组患者中ANA表达比例较高(83.33%,阳性患者滴度从1∶160至1∶1 280),Scl-70阳性率为(16.67%,阳性患者从+至3+),见表1。

表1 患者临床资料及血清学指标

2.2M1/M2型巨噬细胞在两种疾病皮损中的表达分布情况 LS组和SSc组皮损的真皮浅深层血管周围及胶原束间可见CD68+总巨噬细胞表达均较对照组升高(图1),分别为LS组(32.54±12.12)/HP、SSc组(21.83±7.28)/HP和对照组(6.70±2.83)/HP。LS、SSc组和对照组相比差异有统计学意义(t=6.61、6.27,P<0.05),见图2。其中,特异性表达iNOS的M1型巨噬细胞在LS组和SSc患者真皮浅层仅有较少淡棕色阳性着色(图1),与对照组染色结果相似,分别为LS组(11.29±8.65)/HP、SSc组(13.08±7.41)/HP和对照组 (8.05±4.69)/HP,差异无统计学意义(t=1.11、1.93,P>0.05)。然而,特异性表达CD163的M2型巨噬细胞在真皮浅深层的血管周围和胶原束间均有深棕色中等密度表达(图1),分别为LS组(42.48±18.77)/HP、SSc组(38.63±17.71)/HP和对照组(10.42±3.55)/HP,疾病组和对照组之间差异有统计学意义(t=5.32、4.94,P<0.05),见图2。

图1 CD68、iNOS、CD163在LS组、SSc组和对照组皮损的免疫组织化学染色结果 (×400)

Note:**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1,ns P>0.05.

2.3M2型巨噬细胞浸润与病程相关性 将LS组患者根据病程长短(起病至皮损取材的时间)分层为LS早期组(≤1年,12例)和LS晚期组(>1年,12例),真皮CD163+细胞浸润数量分别为(45.43±18.34)/HP和(39.52±19.52)/HP,两亚组间M2型巨噬细胞浸润的数量相当,差异无统计学意义(t=0.77,P>0.05)。同样,将SSc组患者按病程分为早期组(≤1年,8例)和晚期组(>1年,10例)得到一致趋势,差异无统计学意义(t=0.45,P>0.05)。

2.4M2型巨噬细胞和真皮胶原容积的相关性 通过Masson三染色可显示真皮胶原束形态和分布,LS组和SSc组中胶原束粗大增厚,胶原间隙变窄,而对照组真皮中可见纤细弯曲的胶原束错落有致排列(图3)。通过ImageJ分离颜色通道所得的灰度图计算CVF发现,LS组和SSc组的CVF均远高于对照组,分别为LS组(75.81±5.43)%、SSc组(68.33±8.37)%和对照组(55.53±3.83)%(t=10.71、4.55,P<0.05)。Pearson相关性分析显示,LS皮损和SSc皮损中M2型巨噬细胞表达均与CVF无明显关联(r=-0.06、-0.12,P>0.05)。

图3 LS组、SSc组和对照组皮损真皮Masson染色 (×200)

3 讨论

局限性硬皮病和系统性硬化症是一组与T淋巴细胞、巨噬细胞失衡相关的自身免疫疾病,皮肤可表现为纤维硬化。血液中静息状态的单核/巨噬细胞M0在外伤、炎症等刺激因素作用下募集至皮肤组织,转化为经典M1型或替代激活M2型细胞发挥作用,这个过程称为极化［5］。经典M1型巨噬细胞在组织创伤和炎症早期发挥作用,通过释放一氧化氮合酶(iNOS,本实验标记蛋白)、白介素IL-1β、IL-6、IL-12和TNF等促进炎症过程、吞噬凋亡细胞或病原体、抗原提呈和促纤维溶解等作用。而组织创伤和炎症后期,替代激活M2型巨噬细胞升高,特异性标记为甘露糖受体-1(CD206)和巨噬细胞清除剂受体(CD204和CD163)。M2型细胞可释放VEGF、EGF、IL-10、TGF-β1等,参与血管增生和组织纤维化等修复过程［5,8］。在不同的疾病、病程和组织器官中巨噬细胞的极化状态和作用可能不同。

本研究发现,LS和SSc患者皮损中的CD68+总巨噬细胞浸润数量显著升高,以CD163+M2型细胞占主导;iNOS+M1型细胞在两组疾病中表达均很低。据文献检索,本研究首次收集了两种以皮肤纤维化为特点的疾病,证实M2型巨噬细胞主导的炎症在皮肤纤维化的早晚期主导作用,而促炎相关的M1型巨噬细胞可能仅参与在极早期的炎症过程中。M2型巨噬细胞不仅在皮损中表达升高,有研究发现SSc患者外周血中单核/巨噬细胞数量增加且凋亡降低［9］,M2型细胞(CD163、CD206、CD204三标)的百分比显著高于健康人［10］,并且与患者肺间质纤维化程度等临床表现正相关。多条细胞通路可参与M2型巨噬细胞的极化,IL-4/IL-13/STAT6、TGF-β1/smad2/3、PPARγ/SOCS1/STAT6等多条通路可以促进静息状态巨噬细胞M0或经典激活M1型向M2型极化［11］。极化后的M2型巨噬细胞如何影响皮肤纤维化仍值得研究。以LS患者为例,Higashi-Kuwata等［12］发现M2型细胞直接分泌大量TGFβ-1,促进成纤维细胞分泌细胞外基质,同时通过增加组织金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)合成而抑制金属蛋白酶类(MMPs)活性,减少胶原蛋白降解。M2型巨噬细胞也可通过分泌IL-10、IL-13、IL-33等Th2型细胞因子促进纤维化过程,同时趋化因子(CCL2、CCL17、CCL22和CCL18等)和金属蛋白酶MMPs也参与到细胞外基质的分泌和重塑中［13］。本实验也证实在LS组和SSc组的早晚期皮损中M2型巨噬细胞浸润数量均较多,M2型巨噬细胞数量并不随病程延长而减少或凋亡,M2型巨噬细胞应该在皮肤纤维化早期即发挥作用。而真皮中M2型巨噬细胞是如何发挥作用的,是否与Th2型细胞及其相关因子互相协同作用也值得进一步研究［14］。本研究值得进一步思考:是否临床中有皮肤纤维硬化的疾病(如:硬肿病、硬化性黏液水肿或硬皮病样GVHD等)均有M2型巨噬细胞的参与?而调节相关炎症细胞和细胞因子可成为皮肤纤维化疾病中的共同靶点。

Masson三染色后测量真皮层CVF可衡量皮损的纤维化程度［15］。本实验中LS组和SSc组CVF较健康组均明显升高。但通过Pearson相关性分析显示,M2型巨噬细胞数量(cells/HP)与CVF无直接线性相关。分析认为,M2型巨噬细胞极化可能为皮损纤维化的早期改变,与相关的Th2型淋巴细胞共同分泌相关白介素、趋化因子和生长因子等,进而激活成纤维细胞活化,促进胶原纤维合成。因此这一复杂的炎症过程中M2型细胞的数量和晚期的“结果”非直接线性相关。

综上所述,LS和SSc患者皮损中均存在巨噬细胞向M2型极化,提示其在病程早晚期均发挥作用,但可能与皮肤纤维化程度无直接线性关联。