木醋液对植物病原真菌呼吸作用的影响

李彦湘， 丁德东， 何 静， 张金花， 赵吉桃， 赵 倩， 候彩霞， 朱 珠

（1.甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070； 2.陇南市科学技术情报研究所，甘肃 陇南 742500）

0 引言

植物侵染性病害是由细菌、真菌、线虫、原生动物和病毒等多种微生物引起的[1]。其中，植物病原真菌是植物病害的主要致病因子之一，可侵染植物的根、茎、叶、花、果等大部分部位[2]。近年来，随着各种作物和经济林病害的频繁发生致使农民收益大幅降低，现阶段化学防治是控制该类病害的主要手段，然而，农药的频繁密集使用，不仅严重影响作物品质，甚至对人类和整个生态环境构成了巨大威胁[3-4]。因此，寻找高效、环保的绿色新型抗真菌药剂已成为亟待解决的问题之一[5-6]。

木醋液是以木材或木材加工废弃物、采伐剩余物及森林抚育采伐获得的枝桠和枝条等炭材在干馏设备中干馏导出的蒸汽气体混合物经冷凝分离后得到的液体，主要由酸类、酚类、酮类和醇类等组成，由于其组分的多样性，木醋液具有抑菌抗炎、抗氧化、改善土壤、促进植物生长和杀虫等功效[7-15]。研究表明，木醋液对多种病原菌具有抑制作用，并且成本低廉、无残留、无污染，已成为当前生物防治的热点[16]。

目前，有关木醋液抑菌作用的相关研究主要集中在细菌，而对植物病原真菌的抑菌机理研究还鲜有报道[17-18]。本研究通过木醋液对7 种供试植物病原真菌的室内毒力测定，筛选敏感菌株，并通过研究其对菌体呼吸代谢的影响，揭示其可能的抑菌机理，为木醋液在植物病害绿色防控中的应用提供理论依据，对农林业可持续发展具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试材料

（1）供试植物病原真菌。木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）、杨生盾壳霉（Coniothyrium populicola）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum） 和链格孢菌（Alternaria alternata），由甘肃农业大学林学院森保实验室提供，经活化后0～4 °C 保存备用。

（2）木醋液。桃壳木醋液，购自石家庄宏森木炭有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 木醋液抑菌活性筛选

采用菌丝生长速率法，供试植物病原真菌于28 °C培养7 d 后取菌饼，分别接种于1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、10.5、14.5、18.5、22.5、26.5 和30.5 μL/mL的木醋液含药培养基平板中央，继续培养7 d 后，并计算其抑制率[19]。以添加同体积的无菌水为对照，每处理3 次重复。

1.2.2 木醋液对供试真菌孢子萌发和芽管伸长的影响

（1）孢子悬浮液的制备。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上接种黄色镰刀菌，28 °C 下黑暗培养7 d，用无菌水冲洗孢子并稀释，最终制成浓度6×106个/mL 孢子悬浮液备用。

（2）木醋液对黄色镰刀菌的孢子萌发和芽管伸长的影响[20]。将孢子悬浮液及不同浓度的木醋液按照1∶1 的比例滴置于载玻片上，使木醋液的终浓度为0、1.5、2.5、3.5、4.5 和5.5 μL/mL（黄色镰刀菌在木醋液浓度为6.5 μL/mL 时不生长），混匀后倒置于滤纸保湿的培养皿中，以添加相同体积的无菌水为对照，28 °C黑暗培养6 h 后在光学显微镜下观察孢子萌发率和芽管长度，以芽管长度超过孢子直径一半记为萌发。每处理3 次重复，每个重复随机取5 个高倍镜视野（每个视野下约20 个孢子）进行镜检。

1.2.3 木醋液对供试真菌生物量的影响

将制备好的孢子悬浮液加入PDB 培养基中，经28 °C、160 r/min 避光振荡培养2 d 后，过滤菌丝并转移至含药PDB 培养基中（木醋液浓度分别为0、1.5、2.5、3.5、4.5 和5.5 μL/mL），经28 °C、160 r/min 避光振荡培养0、3、6、9、12、24、36 和48 h 后，收集菌丝晾干后称质量，每处理3 次重复。以无菌水为对照。

1.2.4 木醋液对菌丝体长时间的呼吸抑制作用

用4 层纱布将PDB 培养48 h 的黄色镰刀菌菌丝过滤后用无菌水冲洗3～4 次后，将适量菌丝体转入新的含药PDB 培养基（木醋液的浓度为0 和4.98 μL/mL）中，置于28 °C、160 r/min 条件下摇床培养。在0、3、6、9、12、24、36 和48 h 时分别吸取2 mL 菌液于氧电极中测定其呼吸耗氧速率，测定前于菌液中打入氧气至含氧量稳定[20]。每个处理3 次重复。

1.2.5 木醋液对菌丝体短时间持续性影响

菌 丝 处 理同1.2.4。分 别 于0、30、60、90 和120 min 时吸取2 mL 菌液于氧电极中测定其呼吸耗氧速率，测定前于菌液中打入氧气至含氧量稳定[20]。每个处理3 次重复。

1.2.6 木醋液对菌体三羧酸循环的影响

以菌体苹果酸脱氢酶（MDH）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的变化情况来表示木醋液对菌体三羧酸循环的影响[21]。采用试剂盒法（上海优选生物科技有限公司）分别测定0、3、6、9、12、24、36 和48 h 下菌丝中SDH 和MDH 活性。以每毫克组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol 的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）定义为一个SDH 活力单位。以每毫克组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol 的2,6-二氯酚靛酚定义为一个MDH 活性单位来定义。每个处理3 次重复，以同体积的无菌水为对照。

1.2.7 木醋液对菌体细胞内能量代谢的影响

参考杨书珍[22]的方法，准确称取菌丝体0.6 g，加入到3%的高氯酸溶液中，充分冰浴研磨后于4 °C 下9 000 r/min 离心10 min。取上清液1 mL，加20%的氢氧化钾溶液80 μL，4 °C 下反应30 min 后于10 000 r/min离心5 min，取上清液置于4 °C 条件下保存待测。

三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和磷酸腺苷（AMP）含量的测定采用高效液相色谱法。高效液相色谱仪为Waters 2 695，检测器为Waters 2 998 PDA 检测器。液相色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS（200 mm×4.6 mm，25 μm），RPC 18 柱，流动相A 为200 mM pH 值6.5 的KH2PO4-K2HPO4缓 冲 液，流动相B 为3%甲醇，等度洗脱，流速0.7 mL/min，进样量10 μL。检测波长为254 nm。

1.3 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2016、Origin 2018 软件完成，试验数据统计及方差显著性分析利用SPSS 22.0 软件，采用单因素方差分析和Duncan's 新复极差法进行差异显著性检验，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 木醋液对7 种病原真菌的抑菌活性

由表1 可知，木醋液对黄色镰刀菌、三线镰刀菌、杨生盾壳霉、链格孢菌、木贼镰刀菌、尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌均有一定的抑制效果（P＜0.05），EC50值分 别 为 4.98 、 5.10、 5.33、 9.69、 10.80、 26.50 和22.04 μL/mL。其中，木醋液对黄色镰刀菌的抑制效果最好。因此，以黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）为供试敏感菌株，进行木醋液抑菌机理的相关研究。

表1 木醋液对7 种植物病原真菌的抑制作用Tab.1 Inhibitory effects of wood vinegar on 7 plant pathogenic fungi

2.2 木醋液对黄色镰刀菌孢子萌发和芽管伸长的影响

由表2 可知，木醋液显著抑制了黄色镰刀菌孢子的萌发和芽管的伸长（P＜0.05）。经28 °C 培养 6 h 后，对照的黄色镰刀菌的孢子萌发了90%以上，而终浓度为5.5 μL/mL 的木醋液处理下的黄色镰刀菌孢子萌发率仅为8.99%。在低浓度（1.5、2.5 μL/mL）处理下黄色镰刀菌的芽管长度分别较对照降低了21.93%和19.54%，当木醋液处理浓度≥3.5 μL/mL 时，芽管长度较对照均降低了55%以上。

表2 木醋液对黄色镰刀菌孢子萌发、芽管伸长和生物量的影响Tab.2 Effects of wood vinegar on spore germination，germ tube elongation and biomass of Fusarium culmorum

2.3 木醋液对黄色镰刀菌生物量的影响

由表2 可知，随木醋液处理浓度的升高，黄色镰刀菌的菌丝生物量逐渐降低，并且呈剂量依赖性（P＜0.05）。供试浓度下，木醋液对黄色镰刀菌的菌丝生物量抑制率分别为17.94%、31.90%、48.75%、75.75%和95.22%。

2.4 木醋液对菌丝体长时间的呼吸抑制作用

由图1 可知，木醋液处理黄色镰刀菌后，菌体呼吸速率随处理时间的增加呈现先升高后降低的趋势，并且对照组始终高于处理组。24 h 时，菌体呼吸速率达到峰值，对照组是处理组的1.13 倍；36～48 h 时，对照组和处理组均呈降低趋势，并且处理组显著低于对照组（P＜0.5）。表明木醋液能明显抑制菌体细胞呼吸。

图1 木醋液对黄色镰刀菌呼吸速率的影响Fig.1 Effects of wood vinegar on respiration rate of Fusarium culmorum

2.5 木醋液对菌丝体短时间的持续性影响

由图2 可知，木醋液处理黄色镰刀菌后，菌体呼吸速率随着时间的增加呈现降低趋势，对照组呼吸速率呈现先升高后降低的变化趋势。0～60 min 时，对照组和处理组无显著差异；60～120 min 时，对照组显著高于处理组（P＜0.05），表明木醋液在处理黄色镰刀菌60 min 后发挥作用。

图2 木醋液对黄色镰刀菌呼吸短时效应的影响Fig.2 Effects of wood vinegar on short-term respiration of Fusarium culmorum

2.6 木醋液对菌丝体三羧酸循环的影响

SDH 和MDH 是三羧酸循环的关键酶，试验通过测定2 种酶的活性探究木醋液对黄色镰刀菌三羧酸循环的影响。

由图3a 可知，木醋液处理下，黄色镰刀菌SDH 活性总体呈现降低的变化趋势，并且对照组始终大于处理组。0～9 h 时，对照组与处理组无显著差异；12～48 h 时，对照组显著高于处理组（P＜0.05）；48 h 时，对照组 SDH 活性（2.00）是处理组（0.78）的2.66 倍。表明木醋液抑制了黄色镰刀菌SDH 活性。

图3 木醋液对黄色镰刀菌SDH 和MDH 活性的影响Fig.3 Effects of wood vinegar on SDH and MDH activities of Fusarium culmorum

由图3b 可知，木醋液处理下，黄色镰刀菌MDH活性整体呈现先增高后降低的趋势，并且对照组始终大于处理组。9 h 时，木醋液处理后，菌体MDH 活性为14.96，对照组为9.23，是处理组的1.62 倍。表明木醋液降低了三羧酸循环中的关键酶，抑制菌体细胞产能。

2.7 木醋液对菌体细胞内能量变化的影响

为探究木醋液对黄色镰刀菌能量代谢的影响，试验对菌体内ATP、ADP、AMP 含量进行了测定。由图4a 可知，木醋液处理下黄色镰刀菌ATP 含量呈下降的变化趋势。0～12 h 时，菌体ATP 含量对照组大于处理组；24 h 时，处理组ATP 含量略有上升，高于对照组。

图4 木醋液对黄色镰刀菌能量代谢的影响Fig.4 Effects of wood vinegar on energy metabolism of Fusarium culmorum

由图4b 和图4c 可知，木醋液处理下黄色镰刀菌ADP 含量和AMP 含量呈现先增高后降低的变化趋势，在9 h 时达到最大，菌体AMP 含量对照组是处理组的1.41 倍，ADP 含量对照组是处理组的6.61 倍。AMP 含量在 0～9 h 间对照组显著高于处理组（P＜0.5），在12～48 h 间处理组显著高于对照组（P＜0.5）。ADP 含量在0～24 h 间处理组显著高于对照组（P＜0.5），在其他时间无显著性差异（P＞0.5）。

由图4 d 可知，木醋液对黄色镰刀菌能荷总体呈降低的变化趋势。在0～3 h 和36～48 h 时，菌体能荷处理组高于对照组，在6～24 h 时，对照组显著高于处理组（P＜0.5），表明木醋液处理条件下的黄色镰刀菌能荷代谢紊乱。

3 结束语

木醋液对7 种供试病原真菌均具一定抑菌活性，并且抑菌作用随时间的增加而增强。其中，对黄色镰刀菌抑菌效果最强，其EC50值为4.98 μL/mL，并且对其孢子萌发、芽管伸长及生物量均有抑制效果。木醋液可通过对菌体细胞呼吸、三羧酸循环和能量合成的阻碍，实现对病原菌的抑菌作用。