耐低温真菌对土壤中吸附态PAHs的降解特性

苏 丹 赵 祥 董昱杉 刘凤飞 王 鑫

（1.辽宁大学环境学院，辽宁 沈阳 110036；2.沈阳大学区域污染环境生态修复教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110044）

多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs）化合物是一类性质稳定、在环境介质中广泛存在，且具有“三致”效应的有机污染物[1]。随着固定化微生物以及生物强化技术的发展，高效优势菌种的纯化分离及其降解特性，成为PAHs 微生物修复技术应用的关键[2]。针对北方寒冷地区多环芳烃污染的土壤修复的技术需求，该研究从鸡西某炼油厂受冻融交替作用的表层PAHs 污染土壤中，筛选分离出1 株以腐殖酸（Humic Acid，HA）吸附态PAHs 为碳源的耐低温菌株——高山被孢霉（Mortierella alpina JDR7），将其作为耐低温真菌降解PAHs，为北方寒冷地区PAHs 污染土壤修复提供了新的生物修复材料.并研究了高山被孢霉（Mortierella alpine JDR7）对冻融土壤中芘（Pyrene，Pyr）和苯并[a]芘（Benzo（a）anthracene，BaP）的降解性能，旨为在北方寒冷地区PAHs 污染土壤微生物修复提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与培养基

腐殖酸（HA）由沈阳奇特尔科技有限公司提供，其交换容量（CEC）为3.74mmol/g。芘（Pyr，纯度＞98%）和苯并[a]芘（BaP，纯度＞98%），丙酮（分析纯），乙腈（色谱纯），二氯甲烷（分析纯），正己烷（分析纯），水为Millipore超纯水。

营养培养基（CM 培养基）：蛋白胨10.0g，葡萄糖10g，酵母粉5g，牛肉膏5g，氯化钠5g，pH 为7.0～7.2，以蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌25 min，固体培养基另加琼脂粉20g/L。

无机盐选择培养基：K2HPO41.0g，（NH4）2SO45g，MgSO4.7H2O 0.5g，pH 为7.0～7.2，以蒸馏水定容，121℃灭菌25min，加入10g/L 的HA 溶液，加入10mg/L～30mg/L Pyr和BaP 的丙酮溶液作为碳源和能源，置于超净工作台紫外灭菌，待丙酮挥发后用于菌种的筛选富集。

1.2 菌株对PAHs 降解试验

试验设计4 个处理组：1）对照（CK）：不加HA 不接菌。2）添加HA。3）接种降解菌（JDR7）。4）添加HA并接菌（HA + JDR7）。

修复试验用土壤采自中科院沈阳生态试验站0～20cm表层清洁土，土壤为草甸棕壤，土壤过2mm 筛后，分装培养瓶中，每瓶3g，121℃高温灭菌60min，冷却后每瓶定量加入Pyr 与BaP 的丙酮溶液，使其初始浓度均为30mg/kg，放置过夜，按10%接种菌悬液，菌体初始浓度为6×106CFU/mL。按5.0%用量投加HA，随时补加无菌水，使土壤水分为30%。置冻融循环箱（ZT-CTH）中避光培养，冻融循环模式为-5℃冻结12h，15℃解冻12h，分别在0d，7d，14d，21d，28d，35d 和42d 取样测定土壤中PAHs的残留量。

用高效液相色谱HPLC（Agilent 1200 型）对PAHs 进行测定，色谱柱为C-18 柱（ZORBAX Eclipse）。提取方式如下：称取1g 土样装入50mL 玻璃瓶中，加入20mL 丙酮，15mL 二氯甲烷，10mL 15%的氯化钠溶液，超声波萃取8h。静置1h 后，吸取2mL 有机相，移至净化柱（1g中性Al2O3+1g 硅胶+1g 无水氯化钠）用25mL 正己烷，二氯甲烷（体积比为9 ∶1）淋洗，收集滤出液，浓缩至约1mL，再用柔和氮气吹干，用2mL 乙腈定容后测定，进样量10μL，流动相为乙腈/水= 85 /15（ v /v），流速0.5mL/min，柱温为35℃。试验中设空白对照和平行试验进行质量控制。

2 结果和讨论

2.1 真菌对PAHs 降解能力比较

由图1 可知，2 种PAHs 在培养42 d 后均有不同程度降解，42d 后各处理土壤中PAHs 含量顺序如下：CK ＞HA＞JDR7 ＞HA+JDR7。在低温条件下，Mortierella alpine JDR7 对土壤中Pyr 和BaP 显示出一定的降解能力，42d 降解率分别为68.13%和59.51%。Vacca 等[3]发现用溶液态Phe 筛选获得降解菌不具有直接矿化土壤颗粒吸附态Phe的能力。而该研究筛选的真菌Mortierella alpine JDR7 在土壤中表现出一定对Pyr 与BaP 的降解能力，这是因为JDR7是采用HA 吸附态PAHs 筛选获得的降解真菌，具有直接矿化吸附态PAHs的能力。

此外，由图1 可知，HA 的加入能够提高JDR7 对土壤中Pyr 和BaP 的降解率，42d 降解率分别为82.0%和71.8%，与JDR7 处理（未添加HA）土壤中的降解率相比分别提高13.8%和12.3%，表明HA 对PAHs的增溶作用明显。

图1 不同处理方式处理后土壤中PAHs的去除率

高分子量PAHs的低生物可利用性也是自然条件下污染土壤微生物修复的一个难点，这无疑会阻碍污染土壤修复的进程。PAHs 不易被微生物利用主要是因为其水溶性低，Mortierella alpine JDR7 可降解土壤中Pyr 和BaP，但受土壤中PAHs 生物利用率低的影响，降解率较低，而先用HA 增溶洗提土壤中的PAHs，HA 可在修复体系中形成胶束，降低油-水界面张力，PAHs 能够进入胶束内部或吸附在胶束疏水基上，减少PAHs 在土壤上的吸附，促进PAHs 从土壤有机质中解吸出来，增加其流动性，提高土壤中PAHs的生物有效性[4]，从而提高PAHs的降解率。

2.2 真菌对PAHs 降解速率比较

微生物能分泌一些酶类启动其对PAHs的降解过程，底物（Pyr 或BaP）和酶属于典型的酶催化反应。反应符合Michaelis-Menton 动力学。图2（a）、图2（b）描述了经过4 种不同处理后土壤中Pyr 和BaP 随时间的降解动力学曲线。

图2 不同处理方式处理后土壤中PAHs 含量的动态变化

在试验初始阶段PAHs的降解转化速率均较快，随后则出现缓慢的反应趋势，这是因为初期PAHs 浓度较大，反应速度较快，随后PAHs 浓度降低使反应速度减慢。土壤中PAHs的扩散转运速率远远低于其降解速率，初期降解菌营养供应不足，也有降低反应速度的可能性[5]。

HA 的加入极大地提高了Mortierella alpine JDR7 对PAHs的降解速率，第一周，Pyr 和BaP 的降解速率分别为1.34-1和1.15-1，可分别降解31.36%的Pyr 和26.83%的BaP，添加HA 后，Pyr 和BaP 的降解速率分别提高至1.74-1和1.53-1，可降解40.67%的Pyr 和35.66%的BaP，较未添加HA 时降解能力分别提高29.69%和32.93%。随后5 周，Pyr 和BaP 的降解速率分别为0.32-1和0.28-1，添加HA 后，降解速率分别提高至 0.35-1和0.31-1，较未添加HA 时降解能力分别提高了12.28%和10.69%.

随着时间的推移，进入土壤的PAHs 会出现老化现象[6]。如何将土壤中吸附的PAHs 脱附出来，是提高PAHs 生物降解速率的关键步骤，HA 的加入极大地提高了JDR7 对PAHs的降解速率，原因如下：其一，Mortierella alpinaJDR7的筛选驯化是在吸附态PAHs 作为碳源的环境下进行的，使其从一开始就处于工作的环境，缩短了对吸附态PAHs降解的反应时间；其二，由于微生物细胞通常不能进入小于0.2um 的微孔隙，微生物对微孔隙中PAHs的利用受阻，使土壤中大部分PAHs 与降解菌分隔开[5]，HA 是高分子聚合物，具有亲水性、吸附和络合性，能有效提高PAHs的溶解性和迁移性[7]，促进PAHs 从土壤微孔隙中释放，同时，真菌JDR7 丝状菌丝生长繁密，纵横交错成网状，随着菌丝的生长而移动，使其更好的接触污染物，进而提高其对Pyr 或BaP 的降解速率。

2.3 降解动力学

建立Monod 模型，推导后得到公式（1）。

式中：c为Pyr 和BaP 浓度，mg·kg-1；t为反应时间，d；K为动力学常数。Pyr 或BaP 的降解符合一级动力学特征，结果见表1。

表1 JDR7 对土壤中多环芳烃的降解动力学和参数

经JDR7 处理的土壤中Pyr 和BaP 的半衰期分别为16.6d 和29.1d，在经BaP 处理的土壤中，该株真菌仅用20d 就可以使BaP 浓度减少50%。添加HA 后，缩短了MortierellaalpineJDR7 对PAHs的降解半衰期，Pyr 和BaP的半衰期缩短至13.9d 和17.9d。

对PAHs 有较高降解能力的微生物，不一定同时也具有较高的降解速率，所以实际应用中，要全面考虑菌株的特性，根据实际修复要求选择高效降解菌。采用HA 吸附态PAHs 筛选获得的Mortierella alpine JDR7，在低温条件下对HA 吸附态Phe、Pyr 和BaP 降解能力强，降解速率快，如果要在寒冷地区选择Mortierella alpine JDR7 作为固定化菌株，可添加HA 提高其修复效果。

北方寒冷地区土壤受冻融作用影响，结冻会导致大部分微生物休眠，但冷适应微生物对结冻环境却表现出较高抗性[8]，如将游离的耐冷菌直接应用于PAHs 污染土壤，在实际修复过程中游离菌往往会面临土著菌的竞争、中间代谢产物的毒害、恶劣的环境条件等多重压力，导致有效降解菌存活率低、单位体积降解菌密度低、PAHs降解速率慢。为解决上述问题，可采用固定化微生物技术，以强化耐冷菌对冻融交替条件下PAHs 污染土壤的原位修复效果。

3 结论

高山被孢霉在低温条件下对Pyr 和BaP 均具有一定的降解能力，42d 降解率分别为68.13%和59.51%.加入HA能够提高其对Pyr 和BaP 的降解率，42d 分别提高至82.0%和71.8%，分别提高了13.8%和12.3%。

Michaelis-Menton 动力学方程分析表明，加入HA 能够提高高山被孢霉对Pyr 和BaP 的降解速率，第一周降解速率分别提高29.69%和32.93%。随后5 周，降解速率分别提高12.28%和10.69%。

一级反应动力学模型分析表明，土壤中Pyr 和BaP 经高山被孢霉处理后半衰期分别为16.6 d 和29.1d，添加HA后，半衰期缩短至13.9d 和17.9d。