多肉植物红宝石快速繁殖体系的建立

伍茗,唐映红,2,罗璐,郑伊倩,谢丹妮,何奕奕

(1. 湖南文理学院生命与环境科学学院,湖南常德,415000;2. 常德市农业生物大分子研究中心,湖南常德,415000)

近年来,多肉植物在市场中掀起一股热潮,成为现代家庭绿化的新宠。景天科是多肉植物中重要科之一,在园艺应用中较为广泛[1]。多肉植物红宝石(Sedeveria'Pink Ruby')为景天科拟石莲花属植物,是小型多肉品种,由韩国引入国内。其叶片光滑,为细长匙状,前端较肥厚、斜尖,呈莲花状紧密排列,整体呈包裹状,秋冬季节变红或者夏天变绿的时候观赏价值都很高,是大众非常喜爱的品种[2]。

红宝石繁殖主要以枝插法和叶插法为主,繁殖率较低,增殖速度较慢; 红宝石喜爱阳光充足、凉爽和干燥的环境,夏季高温时,处于休眠期,生长缓慢或完全停止,在冷凉季节才处于生长期,因此受环境条件影响较大,难以满足市场需求。植物组织培养可不受外界环境影响而使其快速生长,性状稳定遗传。目前已有景天科“初恋”(Echeveria cv. Huthspinke)、“白牡丹”(Graptoveria Titubans)、“冬美人”(Pachyveria Pachytoides)[3]、松塔景天(Sedum reflexum)和粗壮景天(Sedum spectabilecv.Meteor)[4]、玉露(Haworthia cooperi)[5]、劳尔(Sedum clavatum)[6]、大和锦(Echeveria purpusorumBerger)[7]、黄丽(Sedum‘Golden Glow’)[8]、石台景天(Sedum shitaienseYan Zheng et D. C. Zhang)[9]、青锁龙(Crassula muscosaL.)[10]、八宝景天(Sedum spectabile‘StarDust’)[11]等多肉植物组织培养的研究。不同品种多肉植组织培养方案不同[12],目前有关以红宝石叶片作为外植体进行组织培养的文献报道不多,且已有的培养红宝石的培养基诱导率不高[13]。因此,本研究以红宝石为材料,建立红宝石无菌快速繁殖体系,为红宝石的工厂化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红宝石购自湖南省常德市丹洲多肉植物园(图1A),本试验以幼嫩红宝石叶片(图1B)为外植体。

图1 红宝石

1.2 试验方法

1.2.1 外植体消毒

在超净工作台上先用75%乙醇浸泡30 s,再用2%次氯酸钠浸泡10 min,然后使用无菌蒸馏水快速洗3–4 次,最后使用滤纸吸干外植体表面水分,备用。接入培养基7 d 后观察污染情况,并计算污染率,污染率(%)=污染叶数/接种总叶数×100%。

1.2.2 增殖分化培养

将已经消毒的外植体接入增殖分化培养基中,每瓶接种2 个叶,重复2 次。增殖分化培养基设计3因素3 水平的正交实验(见表1)。其中培养基中含琼脂(7 g·L-1),蔗糖(30 g·L-1),pH 值为5.8。培养60 d后记录红宝石叶的增殖分化情况,统计叶增殖分化出芽的个数,计算增殖系数,增殖系数=增殖后芽数/接种外植体数。

表1 增殖分化培养基组成成分

1.2.3 生根培养

生根培养基选择正交表L8(4×24)的正交实验(见表2)。其中培养基中含琼脂(8 g·L-1),蔗糖(30 g·L-1),pH值为5.8。每瓶接种5 个叶和芽,重复2 次。培养60 d后记录红宝石叶和芽的生根情况,统计每个处理组的生根叶和芽数。生根率(%)=生根芽数/接种芽数×100%。

表2 生根培养基组成成分

1.2.4 培养条件

培养条件为培养温度(26±1)℃,光照时间白天/黑夜为12 h/12 h,光照强度为2 000 Lx。

1.2.5 数据处理与分析

用高清相机拍摄红宝石各个培养阶段形态及发生情况。采用Microsoft Excel 2010 进行数据整理,采用SPSS 26.0 软件进行方差分析和多重比较(新复极差法),采用Photoshop 2019 处理图片。

2 结果与分析

2.1 叶的消毒效果

外植体叶经消毒处理培养7 d 后,染菌率为13.89%,说明该消毒方法对红宝石叶的消毒效果较好。

2.2 不同基本培养基、6-BA 和NAA 及其组合培养基对叶增殖分化的影响

表3 为基本培养基、6-BA 和NAA 对叶增殖分化的方差分析,由表3 可知,基本培养基、6-BA 和NAA 对叶增殖分化影响均极显著,且存在互作效应。

表3 基本培养基、6-BA 和NAA 对叶增殖分化的方差分析

表4 为基本培养基、6-BA 和NAA 分别对叶增殖分化的影响,通过多重比较可知,不同基本培养基之间增殖分化差异显著,以MS 的增殖分化效果最好,每个叶可增殖分化出约5.75 个芽,显著高于其他基本培养基。6-BA各水平之间,随着浓度的增加叶增殖分化出的芽数先增加后降低,且各水平之间差异显著,以3 mg·L-1的增殖分化效果最好,每个叶可增殖分化出约4.67 个芽。NAA 各水平之间,随着浓度增加叶增殖分化出的芽数持续升高,以0.8 mg·L-1为宜,显著高于其他水平。

表4 基本培养基、6-BA 和NAA 分别对叶增殖分化的影响(培养60 d)

基本培养基、6-BA 和NAA 不同组合间产生互作效应使得增殖分化效率升高(见表5),以培养基2增殖分化效率最高,培养60 d 后每个叶可增殖分化出约10.75 个芽,显著高于其他培养基,且叶表面及底部都形成大量愈伤组织,增殖明显(见图2A),继续培养至100 d,可形成35 个芽(见图2B); 其次为培养基3,每个叶可增殖分化出约5.5 个芽,与其他培养基存在显著差异,叶底部也形成愈伤组织,增殖明显,丛生芽较小(见图2C); 不同浓度配比间产生负互作效应使得增殖分化效率下降,培养基1 和6 增殖系数为1,显著低于其他处理组。综上所述,适合红宝石叶增殖分化的培养基为:MS+6-BA(3 mg·L-1)+NAA(0.8 mg·L-1)。

表5 不同培养基对叶增殖分化的影响(培养60 d)

图2 增殖培养情况

2.3 不同基本培养基、IBA、NAA 和KT 及其组合培养基对叶和芽生根的影响

方差分析结果显示(见表6),各因子的主次效应为NAA＞IBA＞基本培养基＞KT,其中仅NAA 对叶和芽生根影响极显著。通过多重比较可知,NAA 各水平之间,随着浓度的增加生根率也显著升高,以2 mg·L-1的生根效果最好,生根率达到80%。基本培养基、IBA、NAA 和KT 不同组合间产生互作效应使得生根效率提高,以培养基4 和6 生根效果最好,生根率达到100%,显著高于其他处理组(见表7)。综上所述,获得最优红宝石叶和芽生根的培养基为1/2MS+IBA(2 mg·L-1)+NAA(2 mg·L-1+KT(4 mg·L-1)和MS+IBA(4 mg·L-1)+NAA(2 mg·L-1)+KT(0.4 mg·L-1)。将红宝石芽和叶接入生根培养基中,培养15 d 左右,叶片开始膨大; 培养30 d 左右,叶和芽表面和底部形成少量根、根较细长(约3 cm)(见图3A),生根率达到80%; 培养60 d 左右,形成大量根,生根率达到100%(见图3B)。

表6 基本培养基、IBA、NAA 和KT 对叶生根的方差分析

表7 不同培养基对叶生根的影响(培养60 d)

图3 叶和芽生根培养(A.叶生根;B.芽生根)

3 讨论

不同激素浓度对植物愈伤组织诱导、生根、分化的影响不同[13–14],本研究可证明含有细胞分裂素(如6-BA)的培养基中添加一定浓度的生长素(如NAA)能促进多肉植物红宝石不定芽的形成。

本研究红宝石叶增殖分化最优培养基为MS+6-BA(3 mg·L-1)+NAA(0.8 mg·L-1),培养22 d 的红宝石底部已长出绿色小芽,增殖率为100%,与陈伟研究使用MS 的增殖率(培养25 d 分化率66.67%)相比有明显优势。本研究最优培养基仅使用基本培养基添加6-BA 和NAA,相比于陈伟等[15]研究中培养基成分更简单,大大减少了繁育成本,还能在较短的时间获得大量红宝石丛生芽。

本研究最适生根培养基使培养30 d 的红宝石叶片和芽形成大量根,生根率达到80%,与陈伟研究使用1/2MS+ 活性炭(2.0 g·L-1)的生根率(培养30 d 生根率为50%)相比有明显优势。

4 结论

本研究获得的最优培养基分别为: 无菌叶增殖分化培养基MS+6-BA(3 mg·L-1)+NAA(0.8 mg·L-1)+ 琼脂(7 g·L-1)+ 蔗糖(30 g·L-1),无菌叶和芽生根培养基1/2MS +IBA(2 mg·L-1)+NAA(2 mg·L-1)+KT(4 mg·L-1)+ 琼脂(8 g·L-1)+ 蔗糖(30 g·L-1)和MS + IBA(4 mg·L-1)+ NAA(2 mg·L-1)+ KT(0.4 mg·L-1)+ 琼脂(8 g·L-1)+ 蔗糖(30 g·L-1)。研究结果可大大减少繁育成本,快速获得大量优质红宝石组培苗,为红宝石的组培快繁和新品种培育提供技术支持,为工厂化育苗提供理论基础。