针灸治疗血管性痴呆的实验研究进展*

李玉秋,罗本华,凌艳君

广西中医药大学针灸推拿学院,广西 南宁 530000

血管性痴呆(vascular dementia,VD)常继发于脑动脉粥样硬化或脑卒中后,是由缺血性脑血管疾病引起的认知功能障碍综合征,临床表现为记忆或认知功能受损,伴运动、语言、视空间、人格障碍等[1-2]。随着社会人口老龄化和脑卒中存活率的提高,VD发病率逐年升高,患者会出现严重的记忆和认知功能缺损,不仅影响生活质量,而且造成了巨大的社会和家庭负担[3-4]。VD是可以早期预防并有治愈可能的痴呆类疾病,已经成为痴呆研究领域的重点之一,但由于疗效不明确及不良反应较多,目前世界范围内尚没有药物化合物被批准用于VD的治疗[5-6]。近年来,大量研究发现针灸能够多靶点、多途径改善VD患者认知障碍,为有效且相对安全的治疗方法[7-8]。现将近年针灸治疗VD的相关实验研究进展综述如下。

1 改善神经行为学

VD动物模型的疗效评价主要是通过神经行为学的改变进行判定,目前多采用水迷宫、Y-型迷宫、穿梭箱实验、跳台实验等评分方法,侧重于客观评估动物学习、记忆等行为的改变。朱钰等[9]采取双侧颈总动脉永久性结扎法制作大鼠VD模型,运用Morris水迷宫实验进行行为学测试,发现与模型组大鼠比较,经“调心通督”针刺法(斜刺水沟、神庭、百会、风府、大椎、命门穴,直刺大陵、劳宫、内关穴)干预的VD大鼠,穿越原平台次数增加,平均逃避潜伏期缩短,学习记忆能力得到明显改善。桂利[10]以“化瘀通络”灸疗法(每日灸“大椎”“百会”“神庭”穴20 min)治疗VD模型大鼠3周后,受试的各组大鼠进行每日4次、每两次训练之间间隔至少10 min的水迷宫训练,并于第5日进行空间探索测验,最终发现艾灸组的成绩明显优于模型组,“化瘀通络”灸疗法具有与西药鼠神经生长因子相同的疗效。鞠庆波等[11]采用Y-型迷宫检测眼针(眼针肝区、心区、肾区)对VD大鼠的记忆能力进行测试,每天记录大鼠跑向迷宫安全通道按下箱顶信号灯的时间,发现眼针组大鼠Y-迷宫箱成绩明显优于模型组。陈晶等[12]选用“风池”“供血”两个经验要穴,通过电针接入刺激干预模型VD大鼠,以Y-型迷宫检测学习记忆能力,发现大鼠Y迷宫学习与记忆的正确次数显著提高。马莉等[13]采用额区电针法干预VD大鼠,以穿梭箱实验测评大鼠行为学变化,结果显示,治疗后VD大鼠电击次数与电击时间明显缩短,证实认知学习能力有所提升;西药组与电针组相比,差异无统计学意义,说明针刺在改善大鼠行为学方面具有与西药脑复康水同等的改善效果。李岩等[14]采用“醒神开窍”针刺法进行干预,发现针刺大鼠在穿梭箱实验中遭受电击次数、电击时间、主动回避次数的成绩显著优于模型大鼠。杨春壮等[15]予VD大鼠针刺百会、大椎、人中穴治疗,30 d后,通过大鼠跳台实验检测VD大鼠的行为学,发现针灸组大鼠跳台检测反应期(即大鼠跳到安全台躲避电击的时间)较模型组明显缩短,提示针灸对大鼠的认知行为有改善作用。乔晓迪等[16]选取跳台实验动态观察耳针对VD大鼠行为学的影响,取“心”“肾”“皮质下”等耳部穴位,分别以治疗后30 d和60 d后作为测试时间点,结果发现经耳针治疗的大鼠跳台潜伏期均显著增加,跳台错误次数均减少,证明耳针对VD大鼠的认知障碍具有明显的改善作用。

2 抑制神经细胞凋亡

一定的外界生理或病理条件会诱发细胞产生凋亡刺激信号,此时基因自主控制细胞为了保持内环境稳定而进行的自主性死亡过程为细胞凋亡[17-18]。研究发现,神经细胞凋亡是大脑缺血后引发脑神经元损伤的一种机制[19-20]。脑部缺血再灌注会引起细胞凋亡,细胞凋亡的加重又促进了VD的发生[21]。凋亡过程需多种蛋白质参与,以B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)两大家族为主,这两大家族能较好地接收、传导和扩大细胞内外的凋亡信号[22-23]。研究表明,针灸可通过调节这两类蛋白的表达抑制神经元凋亡,改善记忆能力[24]。鹿俊磊等[25]采用免疫组化染色法检测VD大鼠海马组织,发现头穴丛刺的干预可上调抗凋亡基因Bcl-2,下调促凋亡基因Bax、凋亡执行蛋白酶caspase-3阳性细胞,并进行动物行为学学习记忆能力测试,推测头穴丛刺改善VD学习记忆能力与抑制细胞凋亡相关。郭菲等[26]观察电针干预(大椎、百会、后三里、膈俞)对VD大鼠海马组织相关蛋白表达的影响,结果显示,电针可显著降低凋亡执行启动蛋白酶caspase-8、执行蛋白酶caspase-3表达,及下调 c-Jun 氨基末端蛋白激酶(c-Jun NH2-terminalprotein kinase,JNK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)蛋白表达(caspase凋亡级联反应激活蛋白),从而抑制脑缺血再灌注对海马神经元造成的损伤。朱雯等[27]于造模后采用针刺足三里、百会穴进行干预,应用免疫荧光法、尼氏染色法(Nissl staining)、TUNEL法分别观察VD大鼠皮质的p-JNK 表达、神经元形态学改变、神经元凋亡情况,发现针刺治疗可抑制VD模型大鼠皮质p-JNK 的表达,改善神经元细胞核固缩、深染情况,减少细胞凋亡数量。张鑫等[28]采用通督调神针刺疗法(穴选“百会”“大椎”“脾俞”“肾俞”)干预,以Morris水迷宫检测空间学习记忆能力后,分离各组大鼠海马组织,观察各组大鼠海马的细胞凋亡数量及促凋亡蛋白磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)表达,结果发现,经通督调神针刺疗法干预的VD模型大鼠细胞凋亡数量及促凋亡蛋白 PTEN表达显著降低,学习记忆能力明显改善。陈英华等[29]运用四血管阻断法制作VD大鼠模型,对模型大鼠分别进行手针及电针治疗后,采用免疫组化法检测海马组织,发现不论是手针组还是电针组(均选用神聪穴、风池穴干预),均能有效抑制脑组织细胞凋亡相关蛋白caspase-3、NF-κB p65及PTEN mRNA表达,提示针刺对脑缺血再灌注具有脑保护作用。

3 调节神经递质

脑中常见的神经递质有胆碱类、单胺类、氨基酸类等,这些神经递质系统参与大脑的学习、记忆功能,是中枢神经系统的重要组成部分,研究发现这些神经递质的异常代谢不同程度地参与了VD的病理过程[30-31]。李新华等[32]在采用两血管阻断加硝普钠降压法造模后,通过对比西药尼莫同组,观察交通任督法(针刺“风府”“百会”“人中”“关元”)对VD大鼠学习记忆功能及海马乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性的影响,证实交通任督针法可明显改善VD大鼠海马组织的AChE含量异常减少现象,增强学习记忆能力。杨晓波等[33]采用反复夹闭双侧颈总动脉-再灌注法复制VD大鼠模型后,观察温通针法对其海马烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)亚单位蛋白表达水平的影响,发现温通针法可通过上调VD大鼠海马nAChR表达来改善学习记忆能力。董娟等[34]以交通任督针法干预VD大鼠,发现干预大鼠与模型组比较,海马组织的5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量明显提高,差异具有统计学意义,从而得出交通任督法针刺对VD大鼠海马单胺类递质的代谢紊乱及认知障碍具有改善作用的结论。杨俊丽等[35]以头穴丛刺长留针法为治疗方法,取大鼠的额区、顶前区、顶区,留针6 h,治疗4周后,发现VD大鼠海马组织ACh含量明显增多,多巴胺(dopamine,DA)、5-HT含量升高,头穴丛刺可调节记忆相关的神经递质的释放,减轻神经元受损程度。张秀景[36]发现,采用电针刺激“大椎”“百会”“膈俞”“后三里”穴可以明显增加VD模型小鼠海马组织的单胺类神经递质去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、DA和5-HT含量。仲秀艳等[37]观察电针针刺肾俞、膈俞、百会穴对VD大鼠海马谷氨酸 (glutamate,Glu)、γ-氨基丁酸(γ-AminobutyricAcid,GABA)含量的影响,用氨基酸自动分析仪检测,结果发现,电针可显著升高VD大鼠海马的抑制性氨基酸GABA含量,降低海马组织兴奋性氨基酸Glu含量,对大鼠的学习记忆能力有改善作用。张茜等[38]采用电针(百会、大椎、膈俞、后三里)干预VD模型大鼠,并检测大鼠海马组织中的Glu含量和N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)蛋白表达量,结果发现,电针组Glu含量及NMDAR表达量较模型组明显降低,提示电针治疗可通过抑制Glu-NMDAR的神经兴奋毒性,对抗神经细胞损伤。

4 减轻氧化应激损伤

脑部慢性缺氧缺血是VD重要的病理学基础,缺氧缺血可引发脑组织氧化应激反应,造成大脑神经元损伤,从而导致认知障碍[39-40]。脑缺血期间产生的过量氧自由基会攻击细胞生物膜,导致血脑屏障被破坏,血管内皮与血小板黏附功能增强,脑组织的微循环障碍加重,同时也造成脑细胞内氧化磷酸化的失调,使神经功能受损[41-42]。人体抗氧化防御系统主要分为抗氧化酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等)和抗氧化剂(维生素C、维生素E、辅酶Q、谷胱甘肽等);人体内主要的自由基有活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)[43-44];氧化应激反应的代谢产物主要有丙二醛(malonaldehyde,MDA),可反映自由基导致细胞损伤的程度[45]。姬军风等[46]造模后选用百会、膈俞、膻中、气海、三阴交穴(益气活血方)治疗VD大鼠,发现针刺可提高大鼠的学习记忆能力,降低海马组织中MDA水平,升高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,具有清除自由基的作用。姜孝德[47]从抗氧化机制角度探讨“嗅三针”对VD模型大鼠的作用机理,通过检测大鼠血清中谷胱甘肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl glycine,GSH)、SOD、MDA的含量,发现“嗅三针”(印堂穴、两侧迎香穴)能明显提高GSH含量及SOD活性,显著降低MDA含量,从而强化VD大鼠的抗氧化机制。孙彦辉等[48]在完成缺血再灌注VD小鼠模型复制后,予“百会”“大椎”“膈俞”“足三里”进行电针刺激,干预结束后,观察海马SOD活性,发现造模当日和造模第3天电针组小鼠SOD活性均明显增强,一氧化氮合酶(NO synthetase,NOS)、MDA含量均明显降低,且造模第3天电针组改善明显优于造模当天。杜斯琪等[49]通过DHE染色检测ROS含量,通过黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性,发现与模型组大鼠比较,针刺百会、双侧足三里后,VD大鼠前额叶皮层SOD活性明显升高,ROS含量显著降低,推断针刺可抑制VD大鼠前额叶皮层的氧化应激水平。武泽惠等[50]观察不同频率电针对VD模型小鼠海马组织自由基影响的差异性:选取百会、大椎、膈俞及足三里穴,毫针刺入后接电针仪,分别以不同频率干预,采用硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量,分光光度法测定NOS活性,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,结果发现电针干预后的小鼠海马组织MDA含量明显降低,NOS活性降低,SOD活性提高,提示不同频率的电针治疗均可对抗VD大鼠脂质过氧化损伤,以疏密波2 Hz/80 Hz的干预效果最突出。

5 营养神经,促进神经、血管再生

脑缺血后,脑内血液供应不足,许多研究者以挽救濒临死亡的细胞、神经胶质细胞和血管内皮细胞为重点方向,各种刺激脑内毛细血管生成的干预措施成为治疗VD的新手段。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作为脑部营养性质因子,可激活多种胞内信号,从而刺激受损神经元修复,促进神经细胞再生与增殖,延长神经细胞存活时间[51-52]。刘佩等[53]以BDNF为检测指标,观察不同时相电针治疗(百会、大椎穴)后VD大鼠海马BDNF mRNA表达的变化规律,结果提示电针可提高海马BDNF mRNA的含量,且其表达随着治疗时间的延长而增加。田玥等[54]以盐酸多奈哌齐为对照,探讨通督醒神针法(百会、神庭、人中穴)对VD模型大鼠海马神经再生的影响,用免疫组化法检测BDNF与其酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)的蛋白表达,发现该针法能显著上调VD大鼠BDNF与TrkB的蛋白表达水平,具有促进神经细胞再生的功能。张媛媛等[55]观察VD大鼠BDNF、TrkB表达水平与化瘀通络灸的关系,悬灸百会、大椎、神庭穴,每穴20 min,每天治疗1次,14 d为1个疗程,并将艾灸组按疗程分组,采用免疫荧光实验观察各组BDNF、TrkB表达水平,结果发现化瘀通络灸可上调BDNF及TrkB蛋白的表达,且蛋白表达随疗程的增加而逐步增加。梁慧英等[56]对大鼠海马组织BDNF与突触后致密蛋白-95的蛋白表达影响进行免疫印迹检测,发现采用电针百会、足三里穴治疗的大鼠海马组织中BDNF蛋白质表达均显著增加,推测电针对VD大鼠记忆力的改善可能与BDNF表达增加相关。樊吟秋等[57]观察灸法与VD大鼠神经血管新生的关系,结果发现悬灸百会、大椎和神庭穴可提高模型大鼠海马巢蛋白(nestin)、双皮质素(doublecortin,DCX)和CD34等神经新生及血管再生重要因子蛋白的表达,提示艾灸有助于海马的神经新生和血管生成,改善VD记忆缺陷。王频等[58]对VD大鼠百会穴使用隔附子饼灸,神庭、大椎穴用清艾条悬灸,结果发现VD大鼠海马内促脑血管新生的关键因子血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达显著上调,提示该法可促进要害部位的血管生成。高音来等[59]以海马组织VEGF、血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)蛋白表达为切入点,在成功造模后,采用“调心通督”针法(穴选百会、神庭、水沟、大椎、风府、命门、内关、大陵、劳宫穴)对VD大鼠进行针刺干预,结果提示“调心通督”针刺法能明显上调海马组织VEGF、Ang-1蛋白表达,诱导血管新生,改善VD症状。张曼等[60]采用化瘀通络灸治疗VD模型大鼠,将大鼠剃毛固定后分别于百会、神庭、大椎穴位隔上附子饼,并以清艾条压灸,疗程结束后以大鼠血清VEGF、碱性成纤维细胞生长因子作为干预的观察对象,结果发现化瘀通络灸可以显著增强VEGF和碱性成纤维细胞生长因子的蛋白表达。马莉等[61]在头穴丛刺基础上加用电针治疗VD大鼠,选用额区的前庭、囟会等穴位,发现电针组大鼠的血清VEGF含量明显高于模型组,并于光镜下观察到电针组大鼠海马凋亡细胞显著减少,推测针灸可通过调节血清VEGF含量从而促进脑血管再生,抑制细胞凋亡,改善临床症状。

6 减轻炎症反应

由慢性脑缺血引起的脑组织炎症反应与缺血后的继发性大脑神经元损伤密切相关[62]。当脑部发生缺血后,局部内皮细胞、神经元等被激活,释放白细胞介素-lβ(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α等炎性因子,进一步刺激其他炎性因子的释放,并诱导炎症细胞进入损伤的脑组织,引发炎症级联反应,造成神经元损伤,导致认知障碍[63-64]。黄琳娜等[65]应用头皮针针刺VD大鼠,头针组选头部“倒脏上焦(双侧)、记忆(双侧)、信号(双侧)、思维”穴,经2个疗程治疗后,发现头皮针可减少VD大鼠大脑海马组织中 IL-6 含量,对VD大鼠神经具有保护作用。曹燕[66]对VD模型大鼠予针刺“百会”穴及双侧“足三里”穴治疗后,采用ELISA技术检测海马促炎因子 IL-6 和TNF-α含量,结果显示干预组海马促炎因子 IL-6 和TNF-α含量降低,mRNA表达水平显著下降,提示针刺有抑制神经炎症的作用。房雅楠等[67]选取完骨穴为电针针刺穴位,探讨针灸作用于VD的机制,发现电针完骨穴可以显著降低VD大鼠海马组织炎性细胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA的表达,从而推测针灸可通过抑制海马炎性因子的过度产生来修复受损神经,改善VD记忆障碍。田文静等[68]以头针治疗VD模型大鼠,并用酶联免疫吸附法检测到治疗组大鼠海马组织中炎性介质TNF-α含量显著低于模型组。杨静雯等[69]以双血管阻断法建立的VD大鼠模型为研究对象,观察各组大脑前额叶皮层炎症调节因子Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)表达及下游炎症因子 IL-1β、IL-6的mRNA表达,发现针刺“足三里”“百会”可降低VD大鼠大脑前额叶皮层炎症调节因子TLR4、IL-1β、IL-6的含量,改善学习记忆能力。阮静茹等[70]通过悬灸“关元”“命门”“大椎”穴探讨艾灸对VD大鼠炎性因子的影响,发现经艾灸治疗后,VD大鼠海马组织中促炎因子TNF-α、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)p65、IL-6、IL-1β表达明显下降,推测艾灸干预抑制了VD大鼠促炎因子表达,能够减轻脑缺血后的炎性反应性损伤,进而改善认知功能。

7 讨论

近年来,随着心脑血管疾病发病率显著提高,VD的防治已成为医学界亟须解决的难题,而针灸对于VD患者显著的临床疗效推动了相关动物实验的深入开展。研究发现,针灸能够通过改善VD动物模型的神经行为学、神经细胞凋亡、神经递质异常、氧化应激、炎症损伤及神经血管损伤等途径减轻VD认知障碍,疗效显著,应用前景广阔。但目前研究仍存在一定的不足:(1)在动物模型复制方面,VD造模方法多样,但多数实验采用双侧颈总动脉结扎法及双侧颈总动脉加椎动脉阻断法,这两种造模方法存在动物病死率高、操作难度大的缺点,适用于全脑缺血的慢性低灌注型VD,但不适用于临床常见的VD分型,即多发梗死性痴呆,导致可信度差;部分实验采用的血管栓塞法具有与多发梗死的病理损害高度相似的特点,也存在造模难度大以及对操作者要求较高的问题;(2)研究多通过水迷宫、Y迷宫、穿梭箱实验、跳台实验等行为学评分方法对动物认知水平进行测评,仪器设备不统一,且评分判断多受实验者主观因素的影响,客观性不足;(3)机制研究存在局限性,如脑神经元功能、血管病理形态、基因信号通路方面的研究少见报道,研究指标、靶点单一;(4)多数实验研究样本量不足、设计欠严谨,造模后未进一步采用行为学或影像学检测筛选模型,可能会有个别动物模型不符合痴呆标准,降低结果的可信度。故今后的实验研究可从以下几方面入手:(1)探索更具有代表性、操作更为简单的模型复制方法,提高动物存活率,降低造模对操作者熟练程度的依赖性;(2)挖掘更具客观性的动物认知能力评价标准,尽可能减少实验者主观因素的影响;(3)加强脑神经元功能学、信号转导及血管病理形态等方面的机制研究;(4)规范实验设计,提高样本量,造模后利用行为学检测或影像学技术剔除不符合标准的动物模型,为干预方法的可行性提供客观严谨的证据。总之,加强动物实验研究的广度、深度,为针灸治疗VD提供更加充分、科学的实验依据,是推广针灸临床应用、提高VD患者生活质量的重要途径。