叶面喷施羧基化碳纳米管对平邑甜茶幼苗生长及抗氧化系统的影响

吴康，苏安琪，田雪娇，李传收，付志顺，杨静静，宿红艳

(鲁东大学农学院，山东烟台 264025)

纳米材料和植物纳米生物技术是新兴的正处于发展中的国际前沿研究领域，其对世界经济发展以及人们的生产生活会产生非常重要的影响。碳纳米管(carbon nanotubes，CNTs)是一种工程碳基纳米材料，按照所含石墨烯片的层数可分为单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)。 目前，CNTs 已被广泛应用于航空航天、医疗、工业等领域[1-4]。 随着纳米技术的发展，CNTs在植物生物技术以及农业领域(例如纳米农药、纳米肥料、纳米杀虫剂或纳米仿生)的应用受到越来越多的关注[5-6]。 因此，探究CNTs 对植物生长发育的影响及其在植物生长发育中的响应机制，对促进其更好地应用于农业生产和作物管理具有重要意义。

目前国内外已经开展过一系列关于CNTs 影响植物生长发育的研究。 现阶段有关CNTs 对植物生长影响的研究大致持两种观点:一部分研究认为CNTs 对植物生长有促进作用或者没有明显毒性作用，另一部分研究则认为CNTs 能够通过影响植物根系水分吸收、光合作用等过程抑制种子萌发和幼苗生长。 Cañas 等[7]研究表明，相对低剂量的SWCNTs 可以穿透种皮，促进番茄幼苗生长；相反地，Stampoulis 等[8]的研究表明，1 000 mg/L MWCNTs 会诱导细胞产生大量活性氧(ROS)并损伤抗氧化系统，扰乱正常代谢及信号转导过程导致其生物量降低。 此外，有研究表明适宜浓度的CNTs 可以调节细胞内抗氧化酶(如SOD、POD 和CAT)活性，进而提高植物对盐胁迫的耐受性[9-11]。 可以看出，CNTs 对植物生长的利弊与其自身特性、环境条件及植物种类密切相关。

虽然目前关于CNTs 对作物生长发育的影响已有大量研究报道，但受试物种主要集中在拟南芥、番茄、小麦、红波菜和水稻等模式植物及禾本科植物上，而关于CNTs 对木本植物苹果生长影响的研究尚未见报道。 鉴于此，本试验以苹果砧木平邑甜茶幼苗为材料，测定分析不同浓度(0、10、20 mg/L)羧基化单壁碳纳米管(SWCNTs)对平邑甜茶幼苗生长、叶片光合作用、叶绿素含量以及抗氧化酶活性的影响，旨在探讨SWCNTs 对平邑甜茶幼苗生长的影响和作用机理，以期为CNTs在环境和农业生产上的安全使用和处理处置提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2020—2021 年在鲁东大学农学院试验基地进行。 2021 年2 月1 日挑选饱满一致的平邑甜茶种子，用0.2%高锰酸钾消毒30 min，流水冲洗12 h，然后置于4 ℃下沙藏40 天。 SWCNTs 干粉购自中国科学院成都有机化学有限公司(http:/ /www.cioc.ac.cn/)，产品具体参数见表1。

表1 羧基化单壁碳纳米管(SWCNTs)参数

1.2 试验设计与处理

2021 年3 月中旬选择露白一致的平邑甜茶种子播种于穴盘(540 mm×280 mm)中，其育苗基质为蛭石与营养土混合(1∶1)基质，待长至4 片真叶时移栽到培养钵(7 cm×7 cm)中，之后进行正常肥水管理。 称取一定量的SWCNTs 粉末加入到去离子水中，超声分散(100 W、40 Hz)1 h，配制成不同浓度(0、10 mg/L 和20 mg/L)SWCNTs 悬浮液。 待植株长至8 片真叶时，选择长势一致的幼苗，分为3 组，以15 棵苗为1 组，叶面喷施0、10 mg/L 和20 mg/L SWCNTs 悬浮液，分别记为CNTs0、CNTs10 和CNTs20 处理。 每个处理独立重复3 次。 约20 天后，植株表型出现明显差异，收集暴露于SWCNTs 的植株叶片以供指标分析。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生物量测定 处理20 天时，每组随机选取5 株平邑甜茶幼苗，用米尺测定株高；取地上部茎叶用分析天平称取鲜重，之后放入烘箱内，105 ℃杀青30 min 后70 ℃连续烘干72 h，至恒重时记为干重。

1.3.2 光合速率及叶绿素含量测定 选择上午9∶00—11∶00，用LI-6400 光合测定仪测定植株功能叶的光合速率。 叶绿素含量测定采用分光光度法[12]，即利用95%乙醇提取色素，分别测定665、649 nm 处的OD 值，计算叶绿素a、叶绿素b 和叶绿素总含量。

1.3.3 抗氧化酶活性和其它理化指标测定 超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定[13]；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[14]；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度法测定[15]。 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[16]；过氧化氢(H2O2)含量采用TiCl4沉淀法测定[17]。

1.3.4 AsA-GSH 循环系统指标测定 抗坏血酸(AsA) 和脱氢抗坏血酸(DHA) 含量参照Ma等[18]的方法测定。 谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量参照Anderson 等[19]的方法测定。 抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定[20]，监测APX 氧化AsA 引起的290 nm 处光吸收值的下降。 脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性的测定[21]，监测由AsA 的生成引起的265 nm 处吸光值的上升。 谷胱甘肽还原酶(GR) 活性的测定[22]，监测由NADPH 氧化所引起的340 nm 处吸光值的下降。

1.3.5 透射电子显微镜(TEM)观察SWCNTs 在叶片细胞中的分布 将对照和暴露于SWCNTs 的植株叶片放于固定液中，用手术刀切割组织取样1 mm3左右，经脱水、包埋、切片、染色后于透射电子显微镜下观察，并采集图像分析。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Microsoft Excel 2019 和IBM SPSS Statistics 25.0 软件进行统计分析和作图，用One-way ANOVA 方法进行Duncan’s 检验(P＜0.05)，数据取平均值±标准差(n ＝3，3 个生物学重复)。

2 结果与分析

2.1 叶面喷施SWCNTs 对平邑甜茶幼苗地上部生长的影响

如图1 所示，叶面喷施SWCNTs 可显著影响平邑甜茶幼苗株高、地上部鲜重和干重。 与对照相比，不同浓度SWCNTs 处理下，平邑甜茶幼苗株高、地上部鲜重和干重均有不同程度提高，其中10 mg/L SWCNTs 处理下平邑甜茶幼苗株高显著增高21.2%，地上部鲜重显著增加25.7%。

图1 不同浓度SWCNTs 处理下平邑甜茶幼苗表型

2.2 叶面喷施SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片光合作用和叶绿素含量的影响

图2显示，与对照相比，叶面喷施SWCNTs 显著提高平邑甜茶幼苗叶片的净光合速率，其中10、20 mg/L SWCNTs 处理净光合速率分别提高10.9%和12.3%。 随着SWCNTs 浓度升高，叶绿素a、叶绿素b 和叶绿素总含量均有不同程度提高，其中，20 mg/L SWCNTs 处理叶绿素a 含量提高11.7%，叶绿素b 含量提高16.4%，叶绿素总含量提高13.3%。

图2 不同浓度SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片光合作用的影响

2.3 叶面喷施SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片MDA 和H2O2含量的影响

如图3 所示，与对照相比，喷施10、20 mg/L SWCNTs 处理平邑甜茶幼苗叶片的丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量略微增加。 这表明该浓度范围内SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片没有产生明显的毒性作用。

图3 不同浓度SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片MDA 和H2O2含量的影响

2.4 叶面喷施SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

如图4 所示，叶面喷施SWCNTs 可提高平邑甜茶幼苗叶片SOD、POD、CAT、DHAR、APX、GR活性。 SWCNTs 处理组平邑甜茶幼苗叶片SOD、CAT 活性显著高于对照，其中10 mg/L SWCNTs 处理叶片CAT 活性较对照提高23.7%(P＜0.05)，20 mg/L SWCNTs 处理叶片SOD、POD、CAT 活性较对照分别提高25.5%、11.9%和19.6%(P＜0.05)。叶面喷施SWCNTs 后平邑甜茶幼苗叶片APX、DHAR、GR 活性均有不同程度的升高，与对照相比，10 mg/L SWCNTs 处理叶片APX、DHAR、GR活性分别提高28.9%、44.8%和16.6%(P＜0.05)，但10、20 mg/L SWCNTs 处理之间DHAR 和GR活性无显著差异。

图4 不同浓度SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

2.5 叶面喷施SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片非酶抗氧化物质含量的影响

如图5 所示，与对照相比，10 mg/L SWCNTs处理下，平邑甜茶幼苗叶片AsA、GSH 含量分别提高26.1%和18.2%(P＜0.05)，而DHA、GSSG 含量分别降低21.9%和10.5%(P＜0.05)，AsA/DHA和GSH/GSSG 的比值分别升高49.8%和49.3%。

图5 不同浓度SWCNTs 对平邑甜茶幼苗叶片非酶抗氧化物质含量的影响

2.6 SWCNTs 在平邑甜茶幼苗叶片中的分布

为了探究SWCNTs 在平邑甜茶幼苗叶片中的吸收和积累情况，利用透射电子显微镜(TEM)对平邑甜茶叶片进行观察。 如图6 所示，经SWCNTs 处理的叶片细胞中分布着黑色颗粒团聚体，而对照叶片细胞中没有黑色束或团聚体。 这一结果表明，SWCNTs 能被平邑甜茶叶片吸收。

图6 对照(A)和20 mg/L SWCNTs 处理(B)平邑甜茶幼苗叶片透射电镜(TEM)结果

3 讨论与结论

碳纳米管(CNTs)对植物生长的积极影响及其潜在机制先前已有报道。 例如，Seddighinia等[23]研究发现50 mg/L MWCNTs 促进了苦瓜根系和茎的伸长。 我们最近的研究表明，土壤浇灌50、100 mg/L SWCNTs 显著上调杨树茎中纤维素和木质素合成酶(CesA、PAL 和C4H)的活性，促进杨树茎中纤维素和木质素的积累[24]。 本研究中，叶片喷施10、20 mg/L SWCNTs 促进平邑甜茶幼苗地上部的生长。

光合作用在植物生命活动中具有重要意义，纳米材料的应用有助于提高植物光合速率，促进植物生长[25]。 Zhang 等[26]发现，20 mg/L SWCNTs 增加水稻叶片叶绿素含量，促进水稻幼苗叶片的光合作用及其生长发育，显著上调水稻叶绿体发育所必需的VIRESCENT2 和YGL138(t)基因的转录水平。 本试验中，叶片喷施10、20 mg/L SWCNTs 显著提高叶片叶绿素a、叶绿素b 和总叶绿素含量。 光合色素可以通过清除ROS 保护叶绿体，从而减少叶片中的氧化损伤[27]。 叶绿素含量增加表明平邑甜茶幼苗叶片叶绿体保护机制可能被SWCNTs 激活。 最近的几项研究表明，SWCNTs 可以有效地附着在植物光合反应中心的蛋白质上并与光合反应中心交换电子，提高电子传递的阈值以及光能利用效率，将光合作用活性提高3 倍以上[28-30]。 相反地，另一项研究表明，高剂量SWCNTs(300 mg/L)会引起光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心失活以及光系统Ⅰ(PSⅠ)末端的受体减少，导致叶绿体基粒和基质区的膨胀，显著降低净光合速率[30]。 本研究结果显示，SWCNTs 能被平邑甜茶幼苗叶片吸收，但其是否能够附着在叶绿体表面以及是否与叶绿体进行电子交换尚不确定。因此，平邑甜茶幼苗叶片增加的光合活性是由于SWCNTs 和叶绿体之间电子转移的增加还是叶绿素含量增加所致仍需要进一步的探索。

许多研究表明，碳基纳米材料可作为非生物激发因子诱导植物发生一定程度的氧化胁迫，但是植物可通过启动体内抗氧化系统，包括抗氧化物质(AsA 和GSH)以及抗氧化酶(POD、SOD、CAT、APX、GR 和DHAR)，响应CNTs 造成的氧化胁迫[31-34]。 本研究结果显示，10、20 mg/L SWCNTs 均能促进平邑甜茶幼苗叶片POD、SOD、CAT、APX、GR、DHAR 活性升高，这与CNTs 处理苹果无菌苗、蚕豆和鼠尾草等植物中的结果相一致[35-37]。 此外，10、20 mg/L SWCNTs 处理提高平邑甜茶幼苗叶片AsA、GSH 含量，一定程度上降低DHA、GSSG 含量，从而显著提高AsA/DHA、GSH/GSSG 比值。 较高的AsA/DHA 和GSH/GSSG 比值使抗氧化物质维持在较高的还原态，能够直接猝灭ROS[38-39]。 本研究中，10、20 mg/L SWCNTs 处理下平邑甜茶幼苗叶片H2O2、MDA 含量比对照略高，但差异不显著，表明抗氧化系统能正常清除ROS。

综上所述，叶面喷施SWCNTs 能提高叶片叶绿素含量和光合作用，促进平邑甜茶地上部生长，上调抗氧化酶活性，加快ASA-GSH 循环系统的高效运转，使植物细胞保持较高的抗氧化能力。