枯草芽孢杆菌KC1723 的鉴定及生物学特征研究

薛德星，李美，孙作文，李纪顺，扈进冬，高兴祥，李健

(1. 山东省农业科学院植物保护研究所，山东济南 250100；2. 山东省农业技术推广中心植物保护部，山东济南 250100；3. 齐鲁工业大学(山东省科学院)生态研究所，山东济南 250103)

链格孢属(Alternaria)和炭疽菌属(Colletotrichum)病原真菌种类繁多，地理分布广泛，可侵害各种农作物，对全球农业生产造成严重威胁[1]。链格孢属病原菌感染南瓜、甜瓜、西葫芦、黄瓜等瓜类植物引起叶斑病[1-2]。 芸薹链格孢(Alternar-ia brassicae)是全球性植物病原菌，具有很强的环境适应性，能够快速引起十字花科蔬菜黑斑病，给农业生产造成巨大的经济损失[3-4]。 近年来，草莓炭疽病危害日趋严重，其致死率一般在10%～20%，严重可达80%以上，对我国草莓产业造成巨大危害[5]。 化学药剂可以很好地防治病菌感染，但长期大量使用化学药剂会导致病原菌产生抗药性，造成环境污染，且农药残留影响人类身体健康[6]。 生物防治是利用微生物之间的拮抗、竞争等方式阻碍病原微生物繁殖，改善土壤理化性质，促进植物生长，提高植物抗病性[7-8]，具有安全、有效和持久的特点，可以更好地防治植物病虫害[9]。

应用于植物病害的生防细菌、真菌、放线菌等多种菌剂相继被开发，并取得了良好的生防效果[10]。 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种常见的产芽孢杆状细菌，广泛存在于土壤和植物表面，对人畜无毒无害，不污染环境，具有很强的抗逆能力[11-12]，能产生多种抗菌素和抗菌酶，对植物病原菌具有广谱抗性，已成为重要的生防菌之一[13-14]。 目前，枯草芽孢杆菌已经应用在小麦、玉米、大豆、花生、番茄、辣椒、苹果等多种作物上，并取得理想的生防效果[14-15]。 本研究从土壤中分离筛选到一株芽孢杆菌KC1723，经形态学、生理生化特征分析和16S rDNA 基因鉴定，确定为枯草芽孢杆菌，并通过抑菌试验研究其对炭疽菌、链格孢菌的抑菌效果，以期为其生防制剂的开发应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

菌株KC1723:分离自济南地区土壤样本。

供试病原菌:暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)、平头炭疽菌(C. truncatum)、链格孢菌(Alternaria burnsii)，均为山东省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心分离保存。

1.2 主要仪器和试剂

紫外透射反射分析仪，上海骥辉科学分析仪器有限公司；PCR 仪，北京宏达恒业科技有限公司；电热恒温水槽，浙江恒岳仪器有限公司；紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；高速离心机，山东德瑞克仪器股份有限公司。 细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司；其他常用试剂为国产分析纯试剂。

1.3 培养基

细菌基础培养基(LB 培养基)，每升去离子水中加入酵母提取物5 g、胰化蛋白胨10 g、氯化钠10 g，用NaOH 调pH 至7.0，121 ℃下高压灭菌20 min。

1.4 试验方法

1.4.1 菌株的分离筛选 称取5 g 土壤样品，加入装有45 mL 无菌水的三角瓶中，充分振荡混匀，85 ℃水浴20 min，制成土壤悬液。 吸取1 mL 上层液，加入装有9 mL 无菌水的试管中，10 倍梯度稀释至10-2、10-3和10-4；分别吸取0.5 mL，均匀涂布在LB 培养基平板上，倒置于30 ℃恒温培养箱培养1～2 d。

1.4.2 菌株鉴定 形态特征观察:挑取生长优势菌落接种到LB 培养基平板上，30 ℃倒置培养1～2 d，观察菌落生长情况，同时进行革兰氏染色，利用光学显微镜观察菌株的形态特征。

生理生化特性分析:挑取单菌落培养5 d 后进行鉴定试验，包括葡萄糖发酵试验、蔗糖发酵试验、乳糖发酵试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、VP 试验、柠檬酸盐试验、过氧化物酶试验、硝酸盐还原试验、耐盐性试验[15]。

分子生物学鉴定[16]:采用细菌DNA 提取试剂盒提取菌株基因组DNA。 基于16S rDNA 基因设计上、下游引物，分别为27F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。 PCR 反应体系(50 μL):模板DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，2×LA Taq MasterMix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR 反应条件:95 ℃10 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃2 min，35 个循环；72 ℃10 min 。 PCR 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4.3 芽孢杆菌生理生物学特征研究 pH 值对菌株生长的影响:将LB 培养基的pH 值分别调为4、5、6、7、8、9 和10，121℃灭菌20 min 后，按照1∶20体积比接种活化的菌液，30 ℃恒温培养，每小时测菌株生长变化情况。

热处理对菌株活性的影响:挑取芽孢杆菌单菌落接入LB 液体培养基中，180 r/min、30 ℃恒温振荡培养18 h。 芽孢杆菌样品分别在25、40、55、70、85、100 ℃水浴中处理20 min，采用10 倍梯度稀释法依次稀释，进行平板菌落计数。

菌株的抑菌作用:采用平板对峙培养法，以暹罗炭疽菌、平头炭疽菌和链格孢菌为靶标菌，测定菌株的抑菌能力。 每组设3 个重复，记录病原菌菌落直径，计算抑菌率[17]。 抑菌率(%) ＝ (对照平均直径-处理平均直径)/对照平均直径×100。

1.5 数据处理与统计分析

试验所得数据均使用SPSS 17.0 软件进行方差分析，多重比较采用Duncan’s 法(P＜0.05)。 将16S rDNA 基因测序结果与NCBI 数据库中的已知序列进行比对，利用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌KC1723 形态特征

经分离筛选，从济南地区土壤中得到一株芽孢杆菌，定名为KC1723。 在LB 培养基上30 ℃恒温培养36 h，菌落边缘呈不规则齿形，表面突起有皱纹，菌落颜色为白色(图1A)。 在显微镜下，菌株KC1723 呈杆状，产生椭圆形芽孢，芽孢位于细胞中部附近。 革兰氏染色为阳性(图1B)

图1 菌株KC1723 菌落形态(A)及染色情况(B)

2.2 芽孢杆菌KC1723 的生理生化特征

对菌株KC1723 进行葡萄糖发酵试验、蔗糖发酵试验、乳糖发酵试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、VP 试验、硝酸盐还原试验、过氧化物酶试验、柠檬酸盐试验、耐盐试验共10 项常规生化试验，结果表明，菌株KC1723 生理生化反应与枯草芽孢杆菌相同(表1)。

表1 菌株KC1723 的生理生化特征

2.3 芽孢杆菌KC1723 16S rDNA 基因序列分析

扩增的菌株KC1723 16S rDNA 片段长度为1 466 bp，系统进化树显示菌株KC1723 与枯草芽孢杆菌聚为一支，同源性为99.39%(图2)。

图2 菌株KC1723 的系统发育树

通过上述形态特征、生理生化特征及16S rDNA 基因序列分析，将菌株KC1723 鉴定为枯草芽孢杆菌。 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(编号CGMCC No. 24397)。

2.4 不同pH 值和培养基对菌株KC1723 生长的影响

菌株KC1723 生长的适宜pH 值在6.0 ～8.0之间，最适pH 为7.0。 随培养基pH 值升高或降低，菌落生长速度明显减慢(图3)。

图3 不同pH 值对菌株KC1723 生长的影响

2.5 温度对菌株KC1723 的影响

由图4 可知，40 ℃处理20 min 后，细胞数量为1.07×109cfu/mL，随着温度提高，细胞数量逐渐降低。 100 ℃时仍有398 cfu/mL 细胞存活，表明菌株可以很好地耐高温。

图4 不同温度对菌株KC1723 的影响

2.6 菌株KC1723 的抑菌作用

平板对峙试验表明，KC1723 对供试3 种病原菌都有较好的抑菌作用，抑菌率分别为68.3%、66.7%、48.9%，其中对暹罗炭疽菌抑菌效果最好(表2)。

表2 菌株KC1723 对3 种病原菌的拮抗效果

3 讨论与结论

通过细菌形态特征、革兰氏染色镜检结果以及生理生化鉴定，菌株KC1723 与枯草芽孢杆菌的形态及生化特征极为相似；测序及系统进化树结果进一步确定菌株KC1723 为枯草芽孢杆菌。KC1723 生长适宜pH 值为6.0～8.0，最适pH 值为7.0；在10% NaCl 培养液中可以生长；100 ℃处理20 min 仍有 KC1723 菌株存活。 表明菌株KC1723 具有很强的环境适应能力，能够在恶劣的生态环境下存活并繁殖，有利于生防菌开发。

利用微生物防治植物病害具有重要的研究价值和应用前景。 筛选和鉴定有生防潜力的微生物极为关键[9]。 前人研究表明，利用枯草芽孢杆菌防治植物病害具有巨大研究价值和应用潜力[18]。经枯草芽孢杆菌处理后，尖孢镰刀菌古巴专化型、灰葡萄孢、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、麦根腐平脐蠕孢、尖孢镰刀菌的菌丝生长受到显著抑制，PDA培养基上均形成明显的抑菌圈[7]。 本试验通过平板对峙培养法发现菌株KC1723 对暹罗炭疽菌、平头炭疽菌和链格孢菌有较好的抑菌效果，特别对暹罗炭疽菌抑菌率达到68.3%，表明菌株KC1723 对由暹罗炭疽菌、平头炭疽菌和链格孢菌引起的花生炭疽病、大白菜炭疽病和辣椒灰叶斑病具有很好的生防潜力。

本试验分离、筛选并鉴定了一株枯草芽孢杆菌KC1723，并对其培养条件和抑菌效果进行了研究。 为了更好地应用生防菌KC1723，下一步将提取其抗菌活性产物，解析抑菌机理以及开展田间防效研究和评估。