绿盲蝽取食对茶树营养物质及防御酶活性的影响

杨春，孟泽洪，李帅，沈强，张小琴，陈正武

(贵州省农业科学院茶叶研究所，贵州贵阳 550006)

茶叶作为重要的采叶类经济作物，虫害的发生严重影响其产量和质量。 绿盲蝽(Apolygus lucorum)属半翅目盲蝽科，是枣、茶树、葡萄、棉花、桃等多种经济作物上的多发害虫[1-5]。 不同于茶小绿叶蝉、茶棍蓟马等其他茶树刺吸性害虫，绿盲蝽属细胞取食者，取食后茶树嫩梢破损严重几无可利用价值，严重损害茶叶产量及品质。 绿盲蝽在贵州[6]、江苏[7]、山东[8]、湖北[9]等茶区已发展成为春茶期间头号害虫。

在长期的协同进化中，植物面对植食性昆虫的持续侵扰演化出一套有效的诱导防御体系，防御保护酶活性变化是植物诱导防御反应的重要体现。 如南美斑潜蝇幼虫和蚜虫取食黄瓜叶片后，过氧化物酶(POD) 、苯丙氨酸解氨酶(PAL) 、超氧化物歧化酶(SOD) 等保护酶活性显著升高[10-11]。 茶角盲蝽取食后，茶树叶片中多酚氧化酶(PPO)、POD 和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性升高[12]。 何应等[13]研究发现毛花雀稗在蝗虫取食胁迫下能激发POD 和过氧化氢酶(CAT)积极参与防御反应，以维持正常代谢。 可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和内源茉莉酸甲酯等发生变化同样是植物诱导防御机制的具体表现[14-16]。

随着绿盲蝽为害范围的扩大，茶树上绿盲蝽为害的报道增多，但较少涉及茶树自身应对绿盲蝽取食为害的生理生化变化。 因此，本研究以绿盲蝽取食为害不同程度的茶树叶片为研究对象，通过探索初级营养物质(可溶性糖、可溶性蛋白)、防御酶(PPO、PAL、POD、CAT 等)、渗透调节物质(脯氨酸、丙二醛)及防御信号因子(水杨酸甲酯、茉莉酸甲酯)的变化，研究茶树对绿盲蝽不同程度取食为害的防御应答，这对于进一步研究绿盲蝽与茶树的互作关系、实现茶园绿盲蝽的高效防控有着重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试茶品种为‘苔选0310’，来自贵州省茶叶研究所贵阳茶树种质资源圃。 参考张辉[17]、陈嘉静[18]等的取样方法，于2022 年4 月下旬绿盲蝽为害盛期，依据叶片受害面积占总面积的百分比，田间采集4 级受害程度的芽下第二叶作为供试材料(图1)。 0 级，叶片完整未受害；1 级为轻度受害，受害面积占叶片总面积的1%～30%；2 级为中度受害，受害面积占叶片总面积的31%～60%；3级为重度受害，受害面积占叶片总面积的61%以上。 叶片采集后放入液氮速冻，再转入-80℃超低温冰箱保存，待测。

图1 绿盲蝽为害不同程度叶片

1.2 仪器及试剂

仪器:UV-2600 分光光度计；Agilent A1100高效液相色谱仪；BioTek Epoch2 酶标仪。

标准品:茉莉酸甲酯标准品(上海源叶，纯度≥98%)、水杨酸甲酯标准品(上海阿拉丁，纯度≥99.5%)。

1.3 试验方法

1.3.1 初级营养物质含量的测定 可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[19]，可溶性蛋白含量测定采用BCA 法[20]。

1.3.2 防御酶活性测定 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、脂氧合酶(LOX)活性均按照试剂盒方法测定。 试剂盒购自苏州梦犀生物医药科技有限公司。

1.3.3 脯氨酸和丙二醛含量测定 脯氨酸(PRO)含量测定采用磺基水杨酸法[21]，丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法[22]。

1.3.4 水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯含量测定 采用高效液相色谱法测定茶树叶片中水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯含量，其中水杨酸甲酯含量测定参照徐建白等[23]的方法，茉莉酸甲酯含量测定参照吕桂珍等[24]的方法。

1.4 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2010 进行数据统计，用SPSS 21.0 进行差异显著性检验，用Origin 2021绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 绿盲蝽不同为害程度茶树叶片中初级营养物质比较

由图2 可知，不同受害程度的茶树叶片中可溶性糖和可溶性蛋白含量存在一定差异。 可溶性糖含量随绿盲蝽取食程度的加深呈先升高后降低再升高的趋势，轻度受害的叶片中可溶性糖含量最高，中度受害叶片中可溶性糖含量最低，轻度和重度受害叶片中可溶性糖含量与健康和中度受害叶片存在显著差异(P＜0.05)。 可溶性蛋白含量随着受害程度的增加而逐渐降低，健康叶片中可溶性蛋白含量极显著高于受害叶片(P＜0.01)，三种程度受害叶片中可溶性蛋白含量不存在极显著差异，但重度受害叶片中可溶性蛋白含量显著低于轻度受害叶片。

图2 不同绿盲蝽为害程度叶片中可溶性糖和可溶性蛋白含量比较

2.2 绿盲蝽为害对防御酶活性的影响

由表1 可知，茶树叶片中POD、CAT 和PPO的活性均随着绿盲蝽危害程度加深而升高。 健康叶片中POD 活性为108.71 U/g，轻度和中度受害叶片中POD 活性分别为129.87 U/g 和152.69 U/g，重度受害叶片中POD 活性达283.93 U/g。健康和轻度受害叶片中PPO 活性在10 U/g 左右，且不存在显著差异；中度受害叶片中PPO 活性为20.16 U/g，极显著高于健康和轻度受害叶片；重度受害时PPO 活性升至82.92 U/g。 健康叶片中CAT 活性为187.57 μmol/(min·g)，轻度受害叶片中CAT 活性达320.05 μmol/(min·g)，中度和重度受害叶片中CAT 活性略有升高，分别为358.94、376.77 μmol/(min·g)。 可以看出，CAT对绿盲蝽取食胁迫的反应更为快速，轻度受害下CAT 活性便迅速升高；POD 和PPO 同样在应对绿盲蝽取食胁迫时积极响应，在重度受害时两者活性大幅升高。

表1 不同绿盲蝽为害程度叶片中防御酶活性比较

PAL 和GR 活性均随着绿盲蝽危害程度的加深呈现先降低后升高的趋势:健康叶片中PAL 和GR 活性最高，在绿盲蝽取食胁迫下活性下降，中度受害时达到最低点，到重度受害时略有回高。其中GR 活性下降幅度较大，健康叶片中GR 活性为1 018.50 nmol/(min·g)，受害叶片中GR 活性仅为健康叶片的46.1%(中度受害) ～56.1%(重度受害)。

LOX 和APX 活性变化相似，均为先升高后下降再升高的趋势:轻度受害时LOX 和APX 活性最高，LOX 活性在健康叶片中最低，APX 活性在中度受害时最低。 绿盲蝽取食胁迫对茶树叶片中SOD 活性影响较小，健康叶片和轻度受害叶片中SOD 活性显著高于中度和重度受害叶片。

2.3 绿盲蝽不同为害程度茶树叶片中脯氨酸和丙二醛含量比较

由图3 可知，在不同程度的绿盲蝽取食胁迫下，茶树叶片中PRO 含量随受害程度的加深而升高，健康叶片中PRO 含量为10.53 μg/g，极显著低于受害叶片中PRO 含量；轻度和中度受害叶片中PRO 含量分别是15.93 μg/g 和17.32 μg/g，两者间差异不显著；重度受害叶片中PRO 含量为22.47 μg/g，极显著高于其他受害程度叶片。MDA 含量变化不大，健康及各种受害叶片中MDA 含量均在38.0 nmol/g 上下。

图3 不同绿盲蝽为害程度叶片中脯氨酸和丙二醛含量比较

2.4 绿盲蝽不同为害程度茶树叶片中水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯含量比较

绿盲蝽为害使茶树叶片中水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯的含量发生变化(图4)。 其中，水杨酸甲酯含量随受害程度加深而不断降低，健康叶片中水杨酸甲酯含量最高，为2.48 μg/g，极显著高于绿盲蝽取食后的茶树叶片；绿盲蝽为害后，叶片中水杨酸甲酯含量迅速下降，降幅达50%以上，重度受害叶片中水杨酸甲酯含量仅为健康叶片的38.3%。 茶树叶片中茉莉酸甲酯含量的变化存在先降低后升高的趋势，轻度受害叶片中茉莉酸甲酯含量最低，后随着受害程度的加深茉莉酸甲酯含量回升，中度受害叶片中茉莉酸甲酯含量与健康叶片、重度叶片间无显著差异。

图4 不同绿盲蝽为害程度叶片中水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯含量比较

3 讨论

植物所含营养物质是植食性昆虫生长发育能量的来源，害虫取食前后植物中可溶性糖和可溶性蛋白等初级营养物质的变化可作为植物抗虫性研究的生理生化指标之一[25]。 本研究发现，绿盲蝽取食后的叶片可溶性蛋白含量均极显著低于健康叶片，且随着叶片受害程度的增加呈下降趋势。这与苟长青[26]、窦玲玲[27]等的研究结果一致，即植物通过降低可溶性蛋白含量来应对害虫取食为害。

植物在遭受害虫取食、病菌侵染等生物胁迫时，可通过主动积累代谢产物、调节渗透来抵抗胁迫，而脯氨酸是植物细胞中重要的渗透调节物质[28]。 本研究发现绿盲蝽取食胁迫越严重，茶树叶片中脯氨酸含量越高。 结合可溶性蛋白的变化，推测茶树在遭受绿盲蝽取食胁迫后，通过降低蛋白质等营养物质含量、增加脯氨酸等代谢产物含量来调节渗透进而抵御伤害。

植物遭受害虫取食胁迫后存在一定的诱导抗性，主要方式是通过提高抗氧化酶活性，清除植物体内多余氧化自由基，维持ROS 平衡，从而减少害虫取食对植株造成的伤害。 SOD、CAT、POD、APX 和GR 等抗氧化酶在稳定植物ROS 系统、构建植物防御体系中起到重要作用。 李林懋等[29]研究发现，POD 在冬枣防御系统中起主要作用，其活性变化与绿盲蝽为害程度之间相关性最为显著。 Gao 等[30]研究同样发现POD 积极参与葡萄叶片对绿盲蝽的防御反应，其活性随绿盲蝽为害持续时间增加而不断升高。 贾尊尊等[31]研究发现，CAT 积极参与棉花对烟粉虱的防御反应，其活性随烟粉虱取食为害加重而不断升高。 本研究中，CAT 和POD 积极参与茶树对绿盲蝽的防御反应，两者活性随受害程度加深不断升高，其中CAT 对绿盲蝽取食胁迫的反应更为快速，在绿盲蝽轻度取食后其活性便迅速升高。

PAL、LOX 和PPO 积极参与JA 和SA 循环代谢途径，进而参与植物诱导抗性，在辣椒、番茄抵御桃蚜和玉米抵御蚜虫取食的防御反应中起着积极作用[32-33]。 前人研究发现，PAL、LOX 和PPO在参与植物防御体系时反应不一，PPO 对虫害取食反应较快，活性不断升高，重度受害下活性激增[34]；LOX 活性的上升速度快，达到峰值后活性下降[35]；PAL 活性下降但变化相对稳定[13]。 本研究与前人研究结果相对一致，PPO 在茶树应对绿盲蝽取食胁迫中起着积极作用，随绿盲蝽为害程度加深PPO 活性不断升高，且绿盲蝽重度为害下PPO 活性激增；LOX 活性在绿盲蝽轻度为害时达到峰值，然后活性下降；PAL 活性变化相对稳定，受害叶片中PAL 活性略有下降。

水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯是植物系统获得性抗性的关键信号因子[36-38]。 前期研究发现，绿盲蝽为害程度越重的茶树品种，叶片中检测到的挥发性水杨酸甲酯含量越高[6]。 本研究中绿盲蝽取食越严重的叶片中非挥发性的水杨酸甲酯含量越少，结合前期研究结果推测，绿盲蝽取食导致茶树叶片细胞破碎，细胞中的水杨酸甲酯以挥发物的形式迅速释出，并随着受害程度加深释放量加大，释放出的水杨酸甲酯通过趋避害虫或引诱天敌从而起到抗虫作用。 茉莉酸甲酯作为一种常见的信号物质存在于植物体内，具有诱导植物抵御害虫的能力[39]。 本研究发现，在绿盲蝽取食胁迫下，茶树叶片中茉莉酸甲酯含量呈现先降低后升高的趋势。 可能的原因是，轻度受害时，茶树叶片细胞中存储的茉莉酸甲酯以挥发物的形式迅速释放，而在受害程度加深后，茶树加快合成茉莉酸甲酯，积极参与绿盲蝽的防御反应。

4 结论

茶树在受到绿盲蝽取食为害后，叶片中可溶性蛋白、脯氨酸、水杨酸甲酯、茉莉酸甲酯及多酚氧化酶等防御酶均有所变化。 与健康叶片相比，绿盲蝽取食为害后的叶片中脯氨酸含量、PPO 活性、CAT 活性和POD 活性均不同程度升高，表明茶树在面对绿盲蝽取食胁迫时，通过调节渗透物质和防御酶活性积极地进行防御。 水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯参与防御绿盲蝽的作用机理需开展进一步研究。