泰山白首乌根际真菌Penicillium sp. XYR-9活性次级代谢产物研究

吕甫晋 孔大庆 屈敬之 刘熙瑾 李晓玉 潘国军

山东第一医科大学（山东省医学科学院） 生命科学学院，山东 泰安 271016

泰山白首乌（cynanchum bungeidecne）为“泰山四大名药”之首，具有养血益肝、固精益肾及抗衰老等作用[1］。白首乌生长过程中，根系会对根际土壤微生物产生重要影响[2］，其次级代谢产物具有显著的药理活性。

吲哚是重要的含氮化合物，许多天然化合物和合成药物的结构中都包含有这类杂环骨架[3］。吲哚生物碱天然产物结构多样，研究发现其具有降脂、抗糖尿病、抗癌、抗菌等多种生物活性，是开发新型药物的重要来源[4-9］。萜类天然产物生物活性显著，是许多药用植物的活性成分，并为创新药物研发提供了大量重要源头分子或先导化合物，其中许多化合物或其衍生物已被开发成药物[10］。萜类化合物往往结构复杂、手性中心较多，利用化学合成方法工业化生产比较困难，因此需要解决萜类化合物来源及高效、低毒新型抗菌先导化合物的发现问题[11］。

本研究从泰山白首乌中筛选获得的根际真菌，选择最适培养条件，批量发酵获得次级代谢产物，分离鉴定单体化合物结构并评价其生物活性，为新型抗菌药物先导化合物开发提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 白首乌根际土壤样品于2021年10 月13 日采自山东省泰安市的泰山（36°19′120.84′′N，117°13′40.53.54′′E），地下5～20 cm白首乌根茎表面土壤。

1.1.2 分离培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基；孟加拉红培养基。

1.1.3 发酵培养基 真菌Ⅰ号培养基、真菌Ⅱ号培养基、真菌Ⅲ号培养基、真菌Ⅳ号培养基、ISP2培养基、大米培养基、马铃薯葡萄糖肉汤培养基（potato dextrose broth，PDB）。

1.1.4 分析培养基 LB 培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%。

1.1.5 实验菌株 抑菌活性实验采用2 种敏感菌株：金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureusATCC33591）、大肠杆菌（Escherichia coliATCC25922）。

1.2 方法

1.2.1 样品处理与菌株的分离纯化 无菌条件下，配置泰山白首乌根际土壤悬液（1.0 g/L），并通过倍数稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的浓度，各取100 μL分别涂布于PDA、孟加拉红培养基，于28 ℃倒置培养2～7 d，通过平板划线法分离直至获得单菌落。

1.2.2 筛选活性菌株 对分离得到的单菌落进行大米培养基固体发酵25 d，等体积乙酸乙酯萃取，减压浓缩得粗浸膏，并配置成1.0 g/L甲醇溶液。采用药敏纸片法检测次级代谢产物粗提物（10 μL）的抑菌活性：选用敏感菌株大肠杆菌和金黄色葡萄球菌标准菌株，阳性对照药为环丙沙星（0.1 g·L-1），倒置于27 ℃培养箱培养1 d后观察并测量抑菌圈大小。通过筛选获得具有抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活性的4株菌株（抑菌圈直径 ＞ 5 mm），见表1。

并通过筛选不同类型培养基（图1），富集次级代谢产物后，分析次级代谢产物化学丰富度，最终确定发酵菌株为XYR-9，最终发酵条件为大米培养基28 ℃静置发酵。

图1 Penicillium sp. XYR-9在不同培养基中的生长状态

1.2.3 菌株发酵与粗提物的富集 无菌条件下，挑取单菌落至PDB培养基，28 ℃摇床培养3 d；随后按1%接种量，接种至大米固体培养基80 g （共发酵20 瓶），28 ℃静置发酵30 d；发酵结束用100 mL 乙酸乙酯浸泡菌丝体过夜，重复3次后合并滤液，减压浓缩获得粗提物。

1.2.4 单体化合物分离纯化 采用不同极性的石油醚∶乙酸乙酯（V/V） 10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、0∶1各800 mL，获得不同极性段组分，通过薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）和高效液相（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱分析，合并相同的组分，获得5 个组分F1 ～ F5。其中，组分F3、F4 和F5 利用甲醇∶水（V/V）70%、80%、90%、95%、100%各500 mL 进行洗脱，获得亚组分F3.1-F3.4、F4.1-F4.3 和F5.1-F5.6。采用半制备高效液相甲醇∶水（V/V）90%等度洗脱，通过分离纯化亚组分F3.3 得到化合物1（28 mg，tR= 12.450 min）；分离纯化亚组分F3.4后得到化合物2（20 mg，tR= 15.500 min）；分离纯化亚组分F4.2后得到化合物3（21 mg，tR= 6.450 min）；分离纯化亚组分F3.2后得到化合物4 （21 mg，tR= 8.650 min）；分离纯化亚组分F6.1后得到化合物5（21 mg，tR= 6.600 min）。

2 结 果

2.1 菌株的鉴定

通过真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）保守序列扩增，对Penicilliumsp. XYR-9菌株进行了分析鉴定。根据测序结果，在GenBank数据库中进行Blast 比对，搜索同源系列，选取有代表性菌株序列分析构建系统发育树（图2），XYR-9菌株与Penicilliumfructuariae同源性较高，结合菌株形态学（图3）分析，XYR-9鉴定为青霉素属真菌。

图2 根据XYR-9序列构建系统发育树

图3 4株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用的菌株形态照片

2.2 活性代谢产物的结构鉴定

化 合 物1 ～ 5 经 核磁 共振（1H-NMR 和13CNMR）、质谱（mass spectrometry，MS）等进行结构解析。

化合物1：淡黄色固体，ESIMS m/z 421.29 [M+H］+。其13C NMR 和1H NMR 谱图预测结构中具有1个 吲 哚 环（δ 150.86， 139.98， 130.25， 127.92，125.00，120.42， 119.54， 118.39， 111.45）（表2），5个甲基、8个芳香或双键碳（包括4个次甲基和4个季碳）和1 个醇羟基。化合物1 被鉴定为paspaline 3[12］。

表2 化合物1 ～ 5 13C NMR（100 MHz）在CDCl3中的数据

化合物2：淡黄色固体，ESIMS m/z 569.35 [M+H］+。根据13C 和1H NMR 谱图分析其同样含有吲哚环，同时具有二萜结构（δ 129.75， 129.39， 129.32，129.00， 125.09， 125.02， 24.55， 24.46， 22.43，20.91， 16.91， 16.58）（表2），8 个甲基、10 个芳香或双键碳（包括3 个次甲基和7 个季碳）和1 个醇羟基。化合物1被鉴定为shearinine F[13］。

化合物3：淡黄色固体，ESIMS m/z 421.26 [M+H］+。与化合物1的紫外吸收谱图非常相似，提示它们为相似化合物。其13C 和1H NMR 谱图显示有一个双键碳（δ 121.31）（表2）。化合物3 被鉴定为PC-M6-2[14］。

化合物4：淡黄色固体，ESIMS m/z 584.34 [M+H］+。根据13C和1H NMR谱图分析其同样含有吲哚环，具有1 个酮羰基、7 个甲基、12 个芳香或双键碳（包括3 个次甲基和9 个季碳）和1 个醇羟基。化合物4被鉴定为shearinines D[13］。

化合物5：淡黄色固体，ESIMS m/z 420.25 [M+H］+。与化合物1和3的紫外吸收谱图非常相似，提示它们为相似化合物。对比1H NMR谱图发现化合物5 中羟基被氧化为羰基。化合物5 被鉴定为13-desoxypaxilline[15］。化合物1 ～ 5的结构见图4。

图4 化合物1 ～ 5的结构

2.3 化合物的抗菌活性评价

对化合物1 ～ 5进行抗菌活性评价，指示菌株为大肠杆菌（E. coliATCC25922）和金黄色葡萄球菌（S. aureusATCC33591），阳性对照药为环丙沙星（0.1 g·L-1）[16］。结果显示，化合物1 ～ 5对金黄色葡萄球菌标准菌株和大肠杆菌标准菌株的MIC 值如表3所示。

表3 5种化合物抗菌活性评价

3 讨 论

本研究从泰山白首乌中筛选获得次级代谢产物化学丰富度高的根际真菌，鉴定并命名为Penicillium sp. XYR-9。通过选择最适培养条件，确定大米培养基为发酵培养基，综合利用正/反相硅胶柱层析、半制备高效液相色谱和波谱检测，分离鉴定5 个吲哚二萜类化合物，通过波谱检测阐明并确定其结构为已知化合物paspaline 3、shearinine F、PC-M6-2、shearinines D 和13-desoxypaxilline[17］。在抗菌活性评价中化合物1、3和5对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌标准菌株均有一定的抑菌活性，从结构分析中发现，缩酮基团的存在对抗菌活性具有不利影响。

由此可见，泰山白首乌根际真菌具有丰富的新型活性天然产物。从中发现的吲哚二萜类等活性天然产物，可为新型治疗药物先导化合物开发提供新的研究方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突