基于UPLC 指纹图谱和含量测定的积雪草标准汤剂质量评价研究

吕渭升，杨洁，侯栩轩，梁月仪，李振雨，孙冬梅，陈向东，贾小舟，2

（1.广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244；2.广州中医药大学附属第一医院，广东 广州 510400）

积雪草为伞形科植物积雪草Centella asiatica（L.）Urb.的干燥全草，夏、秋二季采收，除去泥沙，晒干[1]。积雪草广泛生长于我国的大部分省份，主产于广西、贵州、云南等地，又名铜钱草、马蹄草、钱齿草等，最早收载于《神农本草经》：“味苦，寒；主大热，恶疮，痈疽，浸淫赤嫖，皮肤赤，身热”[2]，具有清热利湿，解毒消肿等功效[3-4]，临床上主要用于跌打损伤、传染性肝炎、流行性脑脊髓膜炎等[5-6]。积雪草所含化学成分中主要包括三萜类、黄酮类、酚酸类、多炔烯烃类，以及挥发油类成分[7]。《中国药典》2020 年版中以积雪草苷和羟基积雪草苷为指标性成分对积雪草的质量进行控制。羟基积雪草苷具有抗炎、镇静、促进肌肤再生、改善肌肤纹理的作用[8]，而积雪草苷能改善皮肤水油平衡，有助于胶原蛋白的合成[9-10]。因此，积雪草不仅具有良好的药用价值，还具有良好的护肤价值。

中药饮片标准汤剂理论被提出之后，便成为了中药现代工艺转化的标尺，标准汤剂连接了传统中药饮片和现代中药制剂，为控制中药配方颗粒、经典名方和部分使用水作为提取溶剂的中成药的质量提供了参照和研究基础。由于不同的化学成分在水中的溶解度不同，其转移率也会有差异，导致标准汤剂在化学组成上可能与药材饮片不一致[11]，因此对中药汤剂成分的研究更具有临床指导性意义[12-13]。鉴于积雪草水煎剂和其他现代中药制剂在临床上的广泛应用，为保证用药的有效性和安全性，本研究共收集了19批不同产地来源的积雪草药材，炮制成饮片后制备标准汤剂冻干粉，用于建立积雪草标准汤剂的超高效液相色谱（UPLC）指纹图谱，首次同时测定其中的三萜类成分积雪草苷、羟基积雪草苷和黄酮类成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷3 种活性成分的含量，并使用SPSS 软件和SIMCA-P 软件对积雪草标准汤剂指纹图谱进行主成分分析（PCA），对不同产地积雪草制成的标准汤剂质量进行评价，为积雪草标准汤剂质量的整体评价提供思路。

1 仪器与试药

1.1 仪器

YRE-501 小型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；全自动煎药壶（3 L，深圳一枚王有限公司）；JJ600 百分之一天平（常熟市双杰测试仪器厂）；ME204E万分之一天平（梅特勒-托利多公司）；XP26百万分之一天平（梅特勒-托利多公司）；HZ-D（Ш）台式循环水真空泵（上海力辰仪器科技有限公司）；DLSB-5/20 低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；TRL-0.5 真空冷冻干燥机（大连双瑞科技有限公司）；LC-40Dxs岛津超高效液相色谱仪（岛津公司）；HWS28电热数显恒温水浴箱（上海一恒科技有限公司）；KQ-500DE 超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂试药

积雪草苷对照品（批号：110892-201505，质量分数：91.2%，中国食品药品检定研究院）；羟基积雪草苷对照品（批号：110893-201804，质量分数：94.5%，中国食品药品检定研究院）；积雪草苷B 对照品（批号：ST78590120MG，质量分数：98.0%，上海诗丹德生物技术有限公司）；异绿原酸C 对照品（批号：wkq18050905，质量分数：98.0%，四川省维克奇生物科技有限公司）；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品（批号：CFN92172，质量分数：98.0%，Chem Faces）；乙醇、甲醇（西陇科学股份有限公司），倍他环糊精（上海麦克林生化科技有限公司）为分析纯；磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、乙腈（默克股份有限公司）、甲醇（默克股份有限公司）为HPLC色谱级；水为实验室自制超纯水。

1.3 样品及制备方法

19批不同产地收集得到的积雪草药材信息详见表1，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为伞形科植物积雪草Centella asiatica（L.）Urb.的干燥全草，积雪草苷和羟基积雪草苷的总量均符合《中国药典》2020年版“不得少于0.80%”的规定。

表1 19批积雪草药材信息表Table 1 Source information of 19 batches of Centellae Herbs

《中国药典》2020年版一部“积雪草”项下规定积雪草饮片的炮制方法为：除去杂质，洗净，切段，干燥。本研究对积雪草饮片的具体炮制方法为：取积雪草原药材，拣去杂质、变质品，洗净（清水喷淋，并不断翻动药材），用铡刀切制成5～15 mm 的段，干燥，用20 目筛除去碎屑物，即得积雪草饮片。根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》相关规定，建立积雪草标准汤剂冻干粉的制备方法步骤为：分别取积雪草饮片约100 g，煎煮次数为2 次，第1次煎煮加水量为12倍，饮片浸泡时间为30 min，煎煮时间为30 min，煎煮后用200 目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，备用。第2 次煎煮加水量为10倍，煎煮时间为25 min，煎煮后用200 目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并两次滤液，65 ℃减压浓缩，冷冻干燥，即得。按此法制得19 批积雪草标准汤剂冻干粉。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用色谱柱Waters CORTECS T3（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）；乙腈为流动相A，含0.15%磷酸的2 mmol/L 倍他环糊精溶液为流动相B，进行梯度洗脱（0～5 min，13%～16%A；5～10 min，16%A；10～25 min，16%～19%A；25～30 min，19%～22%A；30～40 min，22%～24%A；40～45 min，24%～36%A）；流速为0.30 mL/min；柱温为35 ℃；紫外检测波长为205 nm；进样量为1 μL。

2.2 参照物溶液的制备

取积雪草苷对照品、羟基积雪草苷对照品、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品、异绿原酸C 对照品、积雪草苷B 对照品适量，精密称定，加甲醇制成5 种成分质量浓度分别为218.454、209.425、20.145、25.574、13.505 μg/mL 的混合对照品溶液，作为对照品参照物溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取积雪草标准汤剂冻干粉适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液25 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 精密度试验 取积雪草标准汤剂冻干粉（批号：S4）按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次。以9号羟基积雪草苷色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰的相对保留时间RSD值在0.06%～0.14%范围内，相对峰面积RSD 值在0.68%～1.31%范围内，均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取同一批积雪草标准汤剂冻干粉（批号：S4）6 份，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液。按照“2.1”项下色谱条件测定，以9 号羟基积雪草苷色谱峰为参照峰（S），计算得到各色谱峰相对保留时间RSD值在0.01%～0.15%范围内，相对峰面积RSD值在0.30%～2.84%范围内，均小于3%，说明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取积雪草标准汤剂冻干粉（批号：S4）按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别在制样后0、5、12、16、20、23 h 进样测定，以9 号羟基积雪草苷色谱峰为参照峰（S），计算得到23 h 内各色谱峰相对保留时间RSD值在0.08%～0.23%范围内，相对峰面积RSD值在0.87%～1.37%范围内，说明该供试品溶液在23 h内稳定性良好。

2.4.4 指纹图谱的建立及相似度评价 取19批积雪草标准汤剂冻干粉，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，筛选共有峰，并进行积分。将指纹图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，以S1 号样品色谱图为参照图谱，采用平均数法，经过多点校正，生成叠加图谱和对照图谱（R），共标定11个共有峰，见图1。通过与对照品保留时间及紫外全波长3D 扫描曲线图比较，指认了其中的5 个成分，分别是峰1 槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、峰5 异绿原酸C、峰7 积雪草苷B、峰9 羟基积雪草苷、峰11 积雪草苷，见图2。以9号羟基积雪草苷色谱峰为参照峰（S），计算得到19 批样品中11 个共有峰的相对保留时间的RSD 范围为0.07%～0.50%，相对峰面积的RSD 范围为4.53%～51.89%，说明11 个共有峰峰面积差异较大。相似度评价结果见表2，19 批样品指纹图谱与积雪草标准汤剂对照图谱（R）的相似度均＞0.900，说明19 批积雪草标准汤剂的化学成分种类一致性较好，主要差异表现在各特征峰所代表的化学成分的含量上。

图1 19批积雪草标准汤剂UPLC叠加图谱与对照图谱（R）Figure 1 UPLC superposition fingerprints and control fingerprint（R）for 19 batches of Centellae Herbs standard decoction

图2 混合对照品、供试品与阴性样品的色谱图Figure 2 UPLC chromatograms of mixed reference substances，test sample and negative sample

表2 19批积雪草标准汤剂相似度评价结果Table 2 Similarity results of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction

2.4.5 主成分分析 将19批积雪草标准汤剂指纹图谱中11个共有峰峰面积导入IBM SPSS Statistics 25软件，以峰面积为变量，特征值大于1.0 为主成分因子的筛选标准进行PCA 分析，计算得到主成分特征值和方差贡献率，结果见表3。结果显示，PCA 共提取2 个特征值大于1 的主成分，累积方差贡献率达80.428%，大于80%表明提取的前2个主成分可以代表积雪草标准汤剂指纹图谱共有峰中大部分的信息[14-15]。旋转后的成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小，结果见表4。结果显示，第1 主成分主要反映了峰2、4、5、6、10对其的贡献；而峰8、11对第2主成分的贡献率较大。将共有峰峰面积导入SMICA-P 软件中，进行无监督模式识别PCA，得到主成分散点图，结果见图3。从结果可看出，所有样品均在95%可信区间内，以产地进行分析，同一产地的样品斑点分布较为分散，差异较大。而不同产地之间的样品斑点均存在相互重叠的区域，无明显性差异，这提示了产地可能不是造成积雪草标准汤剂质量差异的主要因素。

图3 19批积雪草标准汤剂PCA得分图Figure 3 PCA score chart of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction samples

表3 主成分全部方差分析Table 3 Variance analysis of all the main components

表4 积雪草标准汤剂主成分因子载荷矩阵Table 4 Principal component load matrix of Centellae Herbs standard decoction

2.5 含量测定

2.5.1 供试品溶液的制备及色谱条件 分别同“2.3”、“2.1”项下方法。

2.5.2 对照品溶液制备 取积雪草苷、羟基积雪草苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1 mL分别含150、200和20µg的混合对照品溶液，即得。

2.5.3 专属性试验 分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品溶液、“2.3”项下供试品溶液及阴性样品（空白溶剂）溶液1 μL，按“2.1”项下色谱条件依法进样测定，结果见图2。结果显示，待测成分积雪草苷、羟基积雪草苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷与相邻成分达到基线分离，阴性样品无干扰。

2.5.4 线性关系考察 精密称取积雪草苷对照品18.654 mg、羟基积雪草苷对照品27.113 mg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品5.325 mg，置25 mL 量瓶中，加80% 甲醇制成每1 mL 含积雪草苷680.498 μg、羟基积雪草苷1024.871 μg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷208.740 μg的混合对照品储备液。

精密量取混合对照品储备液0.5、1、1.5、2、5、10 mL，分别置于25 mL 量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，制得不同浓度的混合对照品溶液，分别含积雪草苷13.610、27.220、40.830、54.440、136.100、272.199 μg/mL，羟基积雪草苷20.497、40.995、61.492、81.990、204.974、409.949 μg/mL；槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷4.175、8.350、12.524、16.699、41.478、83.496 μg/mL 的系列对照品溶液。按照“2.3”项下色谱条件进样测定，记录各个浓度的色谱峰面积。以色谱峰峰面积为纵坐标（y），对照品配制浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，结果表明各对照品在进样量范围内线性关系良好。结果见表5。

表5 各成分线性关系Table 5 Linear relationships of various constituents

2.5.5 精密度考察 精密吸取积雪草标准汤剂供试品溶液（批号：S4），按照“2.1”项下色谱条件重复进样6 次，结果显示积雪草苷峰面积RSD 为0.45%，羟基积雪草苷峰面积RSD 为0.84%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷峰面积RSD 为1.22%，均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性考察 精密吸取积雪草标准汤剂供试品溶液（批号：S4），按照“2.1”项下色谱条件，分别在制样后0、5、12、16、20、23 h 进样测定，结果显示，积雪草苷峰面积RSD 为0.42%，羟基积雪草苷峰面积RSD 为0.77%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷峰面积RSD 为1.13%，均小于2%，表明积雪草标准汤剂供试品溶液在23 h内稳定性良好。

2.5.7 重复性考察 按照“2.3”项下供试品溶液制备方法，取积雪草标准汤剂冻干粉（批号：S4）制备供试品溶液6 份，按照“2.1”项下色谱条件进样测定。结果显示，积雪草苷平均含量为12.127 mg/g，RSD为1.34%；羟基积雪草苷平均含量为20.243 mg/g，RSD 为1.78%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷平均含量为5.334 mg/g，RSD 为1.64%，均小于2%，表明该方法重复性良好。

2.5.8 加样回收率测定 精密称取积雪草苷对照品10.624 mg、羟基积雪草苷对照品16.545 mg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷对照品4.265 mg，置200 mL量瓶中，加80% 甲醇制成每1 mL 含积雪草苷48.445 μg、羟基积雪草苷78.175 μg、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷20.899 μg的混合对照品溶液，备用。

取积雪草标准汤剂冻干粉（序号：S4）适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，平行6份，每份分别精密加入25 mL上述混合对照品溶液，然后按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果显示，积雪草苷、羟基积雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的平均加样回收率分别为100.31%、99.65%、98.70%，结果见表6。根据《中国药典》2020 年版“药品质量标准分析方法验证指导原则”规定样品中待测成分含量在0.1%～1%时回收率限度为90%～108%，含量在1%～10%时回收率限度为92%～105%，所有数据均在此范围内，回收率良好。

表6 积雪草标准汤剂各成分加样回收率试验结果Table 6 Results of recovery tests for various constituents of Centellae Herbs standard decoction(n=6)

2.5.9 样品含量测定 取19批积雪草标准汤剂冻干粉，分别按“2.3”项下方法制备19 份积雪草标准汤剂供试品溶液，各平行两份，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算各批次的积雪草苷、羟基积雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的含量，结果见表7、图4。

表7 19批积雪草标准汤剂的含量测定结果Table 7 Results of the determination of 19 batches of Centellae Herbs standard decoction(n=2)w/%

从表7 可见，19 批积雪草标准汤剂中积雪草苷含量范围为0.39%～2.54%，羟基积雪草苷含量范围为1.47%～3.72%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量范围为0.12%～0.60%，RSD 值分别为50.73%、31.51%和49.58%，说明各批次积雪草标准汤剂各有效成分含量有所差异。在三萜皂苷类成分积雪草苷和羟基积雪草苷含量方面，广西产地相对较高，其他产地差异不大；在黄酮苷类成分槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量方面，除来源于贵州的5 个样品含量较为稳定外，其他各个产地的样品差异较大，暂无明显地域性特征。

3 讨论

在供试品溶液制备方法的考察中，先后考察了提取溶剂（甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇）、提取方式（超声处理和加热回流）、提取时间（15、30、60 min）和溶剂用量（15、25、50 mL）对指纹图谱各个共有峰的影响，优选最佳提取参数。结果显示，采用80%甲醇25 mL，超声处理30 min提取效率最高。

在色谱条件的考察中，对比了乙腈-2 mmol/L倍他环糊精溶液、乙腈-含0.15%磷酸的2 mmol/L倍他环糊精溶液、乙腈-含0.2%磷酸的2 mmol/L 倍他环糊精溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液4种流动相的洗脱效果，结果显示选取2 mmol/L 倍他环糊精溶液作为水相时，色谱峰的分离度较差；乙腈-0.2%磷酸溶液作为水相时积雪草苷B与羟基积雪草苷两个成分难以分离；选择另外两种流动相洗脱时色谱峰较多，分离效果较好，整体响应度适中且无明显差异，结合方法的耐用性及保护色谱柱的角度考虑，选取含0.15%磷酸的2 mmol/L 倍他环糊精溶液作为水相。之所以在流动相中加入倍他环糊精是因为积雪草苷B与羟基积雪草苷是一对乌苏烷型和齐墩果烷型结构的同分异构体，采用普通流动相时往往难以分离，而倍他环糊精则可与不同异构体形成不同空间位阻的包含物，致使它们在色谱柱中的保留时间产生差异，从而达到有效分离[16-17]。

积雪草的三萜皂苷类成分具有抗氧化应激作用、促进组织愈合和改善微循环作用、抗炎、抗焦虑等作用[18-19]。此外，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷属于积雪草中的黄酮醇成分，具有抗感染、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等多种生物活性作用[20-21]。因此，本研究首次建立了UPLC 法同时测定积雪草标准汤剂中积雪草苷、羟基积雪草苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量的方法。结果显示3种成分均能在标准汤剂中稳定存在，能有效从饮片提取传递至标准汤剂之中。同一产地不同批次的样品有效成分含量存在着不同程度的差异，例如广西产地的积雪草苷含量为0.82%～2.54%，羟基积雪草苷含量为1.47%～3.72%，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量为0.12%～0.41%，最大相差约3.5 倍，其他产地也存着同样的差异，不同产地之间无明显的地域性差异。

中药指纹图谱具有专属性高、稳定性好、整体性强的特点，能更全面地反映中药材整体的化学成分信息。因此，本研究建立积雪草标准汤剂指纹图谱，共确定了11个共有峰，并指认了其中5个成分，对控制积雪草标准汤剂的质量具有指导意义。相似度结果显示19 批积雪草标准汤剂与对照指纹图谱的相似度较高，具有较好的一致性。PCA 结果则显示不同产地及来源的积雪草标准汤剂样品无明显地域性差异。积雪草性喜温暖潮湿，对栽培土要求不严，适应性强，繁殖迅速，水陆两栖皆可，因此能广泛分布于国内的大部分地区。有文献研究得出影响积雪草质量的因素除了产地土壤外，还可能与光照条件、种植密度、肥料等有关[22-23]。另外，药材的采收季节、产地加工方式、储存环境等因素也会对积雪草的质量产生一定的影响，下一步可对其他的影响因素进行研究，为积雪草质量标准研究提供参考。