Box-Behnken响应面法优化连翘挥发油的胶体磨包合工艺*

张娜娜，孙 艳，庄华青，王竣楠，郇旭升，张 丽，庄建林，关永霞

（1.鲁南制药集团股份有限公司中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；2.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006）

连翘为木犀科植物连翘[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahls]的干燥果实[1-2]，主要分布于我国山西、陕西、河南、湖北、山东等地。其素有“疮家圣药”之称，有清热解毒、疏肝行气等功效[3-5]。现代药理学研究表明，连翘具有抗菌、抗病毒、抗氧化及抗衰老等多种作用[6-8]。连翘中含有挥发油类、苯乙醇苷类、木脂素类、有机酸类和萜类等化合物。2020年版《中华人民共和国药典》一部[1]规定连翘的含量测定成分为挥发油、连翘苷和连翘酯苷A，因此这3种成分对于连翘发挥药理作用具有至关重要的意义。连翘挥发油含有烯类、烷类、醇类、醛类、酯类等化合物，具有广谱的抑菌、抗氧化、解热抗炎等药理活性，是连翘发挥药理作用的主要物质基础之一[9-11]。

桑菊感冒片是由桑叶、菊花、连翘等8味中药组成的中药复方制剂，具有疏散风热、宣肺止咳的功效，常用于治疗风热感冒。桑菊感冒片的原生产工艺中会将提取的连翘挥发油直接喷洒在物料上，然而挥发油的稳定性较差，易挥发；且成品制剂具有刺激性气味，导致患者口服依从性差；并且片剂制备过程中，易造成物料流动性差，很难压片。因此，根据生产过程中出现的问题，本研究用β-环糊精包合来提高连翘挥发油的稳定性，并改善制剂口感等[12-13]。目前挥发油包合方法有饱和水溶液法、超声法、胶体磨研磨法等。本研究通过包合方法的对比实验筛选出胶体磨研磨法包合连翘挥发油，此法具有包合效率高、操作简单、适合大生产的优势[14-15]。本研究以连翘挥发油包合率、包合物得率及综合评分为指标，采用Box-Behnken响应面法[16-22]，优选了连翘挥发油胶体磨研磨法包合的最佳工艺参数，为含连翘挥发油制剂的工艺改进提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器 Ml6002T型电子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；XL-250型两级胶体磨（温州制药机械设备厂）；GZX-9140MBE型电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；ALPHA型红外扫描仪（布鲁克公司）。

1.2 试药与试剂 连翘药材（批号：20220829）购于哈尔滨福顺堂药材有限公司，由鲁南制药集团股份有限公司中药制药共性技术国家重点实验室范建伟高级工程师鉴定，符合2020年版《中华人民共和国药典》规定；β-环糊精（β-CD）（批号：20190201）购于孟川市华兴生物化工有限公司；蒸馏水、乙醇、乙酸乙酯、正己烷等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 连翘挥发油的提取 称取连翘药材28.0 kg，投入芳香油提取罐中，加入6倍量水，采用水蒸气蒸馏法提取连翘挥发油，开启加热，待提取罐内沸腾后，调节蒸汽阀，提取3 h，至挥发油的油量不再增加，停止加热，读取挥发油量（323 mL），开启挥发油收集器活塞，收集挥发油。于挥发油中加入等体积的无水乙醇制成挥发油乙醇溶液（挥发油与无水乙醇体积比为1∶1），放入冷库保存，备用。

2.2 空白回收率的测定 参照2020年版《中华人民共和国药典》四部项下挥发油含量测定法（通则2204）甲法，精密吸取“2.1”项下挥发油乙醇溶液4 mL，共3份，分别置于圆底烧瓶中，加水600 mL，沸石数粒，保持沸腾5 h，待挥发油测定器中油量不再增加时，停止加热，读取挥发油量，计算得到平均空白回收率为91.32%。

2.3 评价指标 精密称取挥发油包合物（总质量的1/5），分别置于圆底烧瓶中，加水600 mL，沸石数粒，保持沸腾5 h，待挥发油测定器中油量不再增加时，停止加热，读取挥发油量，分别计算包合率和包合物得率。以β-CD挥发油包合率和包合物得率的综合得分Y作为评价指标。根据实际生产经验，赋予包合率权重为80%，包合物得率权重为20%。包合率（%）=包合物中挥发油的含量/（挥发油加入量×空白回收率）×100%；包合物得率（%）=包合物量/（β-CD加入量＋挥发油加入量）×100%；Y（综合得分）=（包合率/包合率max×80%+包合物得率/包合物得率max×20%）×100。

2.4 包合方法比较

2.4.1 饱和水溶液法 称取β-CD 90 g，加入纯化水1 440 mL，水浴加热，搅拌，升温至50 ℃，待β-CD完全溶解后，温度降至40 ℃，用分液漏斗缓慢滴加挥发油乙醇溶液20 mL，不断搅拌（200 r/min），滴加完毕，恒温包合2 h，入库冷藏（0～8 ℃）过夜，减压抽滤，抽滤结束后，取上层挥发油包合物，用95%乙醇冲洗吸附的挥发油，40 ℃烘干，得干包合物。

2.4.2 超声法 称取β-CD 90 g，加入纯化水1 440 mL，超声，水浴加热，搅拌，升温至50 ℃，待β-CD完全溶解后，温度降至40 ℃，用分液漏斗缓慢滴加挥发油乙醇溶液20 mL，不断超声搅拌，滴加完毕，恒温包合2 h，入库冷藏（0～8 ℃）过夜，减压抽滤，抽滤结束后，取上层挥发油包合物，用95%乙醇冲洗吸附的挥发油，40 ℃烘干，得干包合物。

2.4.3 胶体磨研磨法 称取β-CD 90 g，加入纯化水360 mL，玻璃棒搅匀，置胶体磨中研磨，设置转速为2 880 r/min，乳化细度为20 μm，用分液漏斗缓慢滴加挥发油乙醇溶液20 mL，滴加完毕，研磨包合20 min，入库冷藏（0～8 ℃）过夜，减压抽滤，抽滤结束后，取上层挥发油包合物，用95%乙醇冲洗吸附的挥发油，40 ℃烘干，得干包合物。

由表1可知，胶体磨研磨法的包合率、包合物得率、综合评分（Y）均高于饱和水溶液法和超声法。

表1 包合方法的比较

2.5 连翘挥发油研磨法包合单因素考察

2.5.1 连翘挥发油与β-CD的投料比对包合工艺的影响 按“2.4.3”项下方法，固定β-CD与水的投料比为1∶5，研磨时间为20 min，考察连翘挥发油与β-CD的投料比对包合工艺的影响。选择连翘挥发油与β-CD的投料比为1∶6、1∶9、1∶12、1∶15。按“2.3”项下方法进行挥发油包合率与包合物收率的测定，并计算综合得分（Y）。由表2可知，连翘挥发油与β-CD的投料比超过1∶12时Y基本不变，故后续Box-Behnken响应面优化中选择连翘挥发油与β-CD的投料比为1∶6、1∶9、1∶12。

表2 连翘挥发油与β-CD 的投料比对包合工艺的影响

2.5.2 β-CD与水的投料比对包合工艺的影响 按“2.4.3”项下方法，固定连翘挥发油与β-CD的投料比为1∶9，研磨时间为20 min，考察β-CD与水的投料比对包合工艺的影响。选择β-CD与水的投料比为1∶3、1∶5、1∶7、1∶9。按“2.3”项下方法进行挥发油包合率与包合物收率的测定，并计算综合得分（Y）。由表3可知，β-CD与水的投料比超过1∶7时Y基本不变，故后续Box-Behnken响应面优化中选择β-CD与水的投料比为1∶3、1∶5、1∶7。

表3 β-CD 与水的配比对包合工艺的影响

2.5.3 研磨时间对包合工艺的影响 按“2.4.3”项下方法，固定连翘挥发油与β-CD的投料比为1∶9，β-CD与水的投料比为1∶5，考察研磨时间对包合工艺的影响。选择研磨时间为10、20、30、40 min。按“2.3”项下方法进行挥发油包合率与包合物收率的测定，并计算综合得分（Y）。由表4可知，研磨时间30～40 min包合效果相差不大，因此后续Box-Behnken响应面优化中选择研磨时间为10、20、30 min。

表4 研磨时间对包合工艺的影响

2.6 Box-Behnken响应面法优化连翘挥发油研磨法包合工艺 根据上述连翘挥发油研磨法包合单因素考察试验结果，选取用挥发油与β-CD的投料比（A）、β-CD与水的投料比（B）和研磨时间3个因素，用Box-Behnken响应面法进行因素水平设计与试验，试验因素水平见表5，试验设计及结果见表6～7。

表5 连翘挥发油包合工艺试验因素水平

表6 连翘挥发油包合工艺Box-Behnken响应面试验设计及结果

表7 连翘挥发油包合工艺响应面二次回归方程方差分析结果

采用Design-expert8.0.6软件对试验结果进行分析，得到回归方程：Y=95.48+5.68A+3.65B+2.34C+0.069AB-2.66AC-2.17BC-5.76A2-0.27B2-3.73C2，r=0.975 7；建立的回归整体模型P＜0.01。失拟项P=0.146 1＞0.01，模型成立。其中A、B、C、A2、C25个因素差异极显著（P＜0.01），AC、BC差异显著（P＜0.05），各因素对挥发油包合工艺综合得分（Y）的影响大小顺序为A＞B＞C。3个因素对Y的交互影响见图1～3，由图可知，响应曲面表现均较为平滑。连翘挥发油包合工艺综合得分（Y）随挥发油与β-CD的投料比、β-CD与水的投料比和研磨时间的增加呈现出先升高再缓慢降低的趋势，在一定的范围达到最大值。

图1 因素A 和B 对连翘挥发油包合工艺的影响

图2 因素A 和C 对连翘挥发油包合工艺的影响

图3 因素B 和C 对连翘挥发油包合工艺的影响

2.7 连翘挥发油包合工艺验证 根据模型分析结果可以确定连翘挥发油包合最佳工艺：挥发油与β-CD的投料比为1∶10.59，β-CD与水的投料比为1∶6.84，研磨时间为18.7 min。结合生产实际及节能减排的原则，确定最佳提取工艺：挥发油与β-CD的投料比为1∶10，β-CD与水的投料比为1∶6，研磨时间为20min。根据此工艺重复3次试验，包合率平均值为89.52%，包合物得率平均值为93.98%，综合得分（Y）为90.41，RSD为1.21%，说明此工艺稳定可靠。

2.8 连翘挥发油包合物的鉴定

2.8.1 薄层色谱（TCL）鉴别 量取连翘挥发油1 mL，加无水乙醇20 mL，混匀得样品1；量取包合物中回收的挥发油1 mL，加无水乙醇稀释至20 mL，混匀得样品2；称取连翘挥发油β-CD包合物10 g，加入无水乙醇20 mL，超声后过滤，取续滤液，得样品3；称取连翘挥发油β-CD包合物10 g，加无水乙醇20 mL，振摇使溶解，滤过，取续滤液，得样品4；取β-CD 10 g，加无水乙醇20 mL，振摇使溶解，滤过，取续滤液，得样品5。从左到右依次点于同一硅胶G板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果样品1、2、3在相同位置呈现明亮斑点，说明包合过程未改变连翘挥发油的化学成分，样品4、5没有斑点显示，说明包合物制备完成。（见图4）

图4 薄层色谱鉴别图

2.8.2 红外光谱法鉴别 将β-CD、连翘挥发油、连翘挥发油β-CD包合物3个样品分别采用衰减全反射法（ATR）在4 000～400 cm-1范围内进行IR扫描，测定结果见图5～7。由图可知，连翘挥发油在2 921 cm-1和1 642 cm-1有吸收尖峰，而连翘挥发油β-CD包合物在2 920 cm-1仅有较弱吸收，在1 642 cm-1无吸收。这是由于连翘挥发油和β-CD形成相互作用，连翘挥发油β-CD包合物制备完成。

图5 β-CD 红外图谱

图6 连翘挥发油红外图谱

图7 连翘挥发油β-CD包合物红外图谱

3 讨论

本研究选择了饱和水溶液法、超声法、胶体磨研磨法对连翘挥发油包合效果进行比较，结果显示胶体磨研磨法较其他两种包合方法具有包合率高、包合物得率高、操作简单等优势，且可以用作大规模工业化生产。本研究由此在单因素试验基础上结合Box-Behnken响应面法确定了连翘挥发油胶体磨研磨法包合工艺的最优条件为：挥发油与β-CD的投料比为1∶10，β-CD与水的投料比为1∶6，研磨时间为20 min。验证试验结果表明，该包合工艺稳定可行，且通过薄层鉴别和红外光谱鉴别试验结果显示包合物已成功形成。该法可充分掩盖挥发油的刺激气味，减少挥发油的挥发，有利于连翘挥发油药效成分的控制和相关制剂工艺的改进。