基于LC-MS联用技术和网络药理学探讨芍药汤调控肠道菌群防治大肠癌的活性成分及作用机制*

荣耀军，古韶东，张贵育，杨光义，2，巢阳发，綦林华，郝晓将，李晓林，张舞红，何伟燕

（1.广州中医药大学附属宝安中医院，广东 深圳 518000；2.深圳市宝安纯中医治疗医院，广东 深圳 518000）

大肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球发病率及死亡率排名第一的消化道恶性肿瘤。国际癌症研究机构（IARC）预测未来50年全球癌症居首的是CRC[1]。目前西医主要采用手术、放疗、化疗及靶向治疗等方法治疗本病，存在生存率低和放疗、化疗的耐药性高、毒性高等问题。早期CRC患者的5年生存率为90%，局部晚期CRC患者的5年生存率为70%，转移性CRC患者的5年生存率为15%[2]，临床上大多数CRC患者在诊断时已处于中晚期[3]。因此，寻找更加安全有效的临床药物是很重要的。

肠道菌群（intestinal flora，IF）参与了大肠癌发生发展，一些肠道微生物能通过塑造肿瘤微环境或形成生物膜驱动肿瘤的发生。肠道微生物通过屏障效应和抑制DNA损伤来保护肠黏膜，抵抗病原体入侵，并调节肠黏膜细胞的增殖[4]。肠道菌群能影响胆汁酸的合成、代谢和组成，通过改变患者体内胆汁酸的种类或数量来减轻炎症。补充有益菌、移植或改或改善肠道菌群的组成，能缓解疾病的进展[5-6]。有研究表明，肿瘤微环境中TNF-α和IL-1β对核因子-κB（NF-κB）的激活以及IL-6对信号转导子和转录激活子STAT3的激活可加强结肠炎症，诱导不受控制的细胞增殖，并进一步促进CRC进展[7-9]。

芍药汤（Shaoyao decoction，SYD）由白芍、当归、黄连、槟榔、木香、炙甘草、大黄、黄芩、肉桂组成，具有清热燥湿、调和气血之功。SYD经过煎煮浓缩后的主要成分有小檗碱、芍药苷、汉黄芩素及没食子酸等化合物[10]。SYD对DSS诱导的结肠炎小鼠模型有保护作用，包括抑制炎症、抑制受刺激的STAT3和NF-κB信号通路及改善结肠中的肠道屏障功能[11]。SYD也能通过抑制IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子，减弱TAM浸润和NF-κB活化，抑制Snail诱导的EMT来改善CRC[12]。有研究表明，SYD能通过激活GPX4、抑制上皮细胞铁死亡和进一步恢复屏障功能来减轻肠道炎症[13]，并能通过激活Nrf2通路和上调Nrf2下游Ⅱ期酶的表达，有效增强抗氧化能力[14]。SYD能在抗炎和抗氧化共同作用下，通过Keap1-Nrf2-ARE信号通路，预防和治疗与溃疡结肠炎相关的CRC[15]。SYD也能通过抗炎和调节IF改善湿热腹泻大鼠的预后[16]，然而，SYD防治CRC是否与IF有关，尚未见报道。

因此，本研究采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS）分析SYD中主要活性成分，并通过网络药理学及分子对接的方法，从IF角度探究SYD防治CRC活性成分、关键靶点及主要通路，进一步阐明SYD调控IF防治CRC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 白芍30 g（安徽普仁中药饮片有限公司，批号：2102181）、当归15 g（亳州市永刚饮片有限公司，批号：210620）、黄连15 g（亳州市永刚饮片有限公司，批号：201220）、槟榔6 g（广东汇群中药饮片股份有限公司，批号：20210301）、木香（后下）6 g（亳州市盛林药业有限责任公司，批号：CP-030-201201）、炙甘草6 g（广州至信中药饮片有限公司，批号：210601）、大黄9 g（广东汇群中药饮片股份有限公司，批号：20210501）、黄芩15 g（亳州广源堂中药饮片有限公司，批号：210401）、肉桂（后下）7.5 g（安徽亳药千草中药饮片有限公司，批号：2106034）均购自深圳市宝安区中医院，中药均经深圳宝安区中医院张贵育执业中药师鉴定为正品。

1.2 主要仪器 质谱仪（型号：Q ExactiveTMHF，德国Thermo Fisher）；色谱仪（型号：Vanquish UHPLC，德国Thermo Fisher）；色谱柱[型号：Hypesil Gold column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），美国Thermo Fisher]；低温离心机（型号：D3024R，美国Scilogex）。

1.3 样品的制备 采用水煎方法制备SYD，煎煮2次合并，通过旋转蒸发仪浓缩，使药物质量浓度为2 g/mL，储存于-20 ℃冰箱中。将样品（100 μL）置于EP管中并用预冷的80%甲醇通过井涡旋，然后将样品在冰上孵育5 min，在15 000×g，4 ℃离心20 min，部分上清液稀释至最终LC-MS级水测定含53%甲醇的浓度。随后将样品转移到新的Eppendorf管中，在15 000×g，4 ℃离心20 min。最后，将上清液注入LC-MS/MS系统分析[17-18]。

1.4 SYD的活性成分及靶点基因筛选 通过LC-MS对SYD化合物进行检测，并结合文献，筛选出主要活性成分；利用SwissADME数据库对SYD的主要活性成分进一步筛选，根据胃肠道吸收（Gastrointestinal，GI）评分及药物相似性（Drug likeness）大于3个“YES”，并使用PubChem数据库获得SYD主要活性成分2D结构式，将2D结构式输入Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库中，设置属性为“Homo sapiens”，预测出SYD主要活性成分的靶点基因。

1.5 CRC及IF 的靶点基因筛选 通过GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM 数据库（http://www.omim.org/）及TTD 数据库（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）搜索“Colorectal cancer”“Intestinal flora”，筛选去重后，获得CRC及IF的靶点基因。

1.6 交集靶点、蛋白互作分析及Hub基因筛选 通过Draw venn diagram软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）获取SYD、CRC及IF的交集靶点基因；将交集靶点基因导入String数据库，选择Homo Sapiens，进行蛋白互作分析；使用Cytoscape 3.8.0软件，利用cytoHubba插件，通过MCC、MNC、EPC、Degree及Closeness 5种算法，取前10的Hub基因，并获得最终Hub基因。

1.7 富集分析 将交集靶点基因导入Metascape数据库，设置基因物种H.sapiens，选取Custom Analysis，分别对KEGG通路及GO功能（GO Biological Processes、GO Cellular Components、GO Molecular Functions）进行富集分析，将KEGG通路及GO功能数据导入软件，绘制KEGG气泡图及GO柱形图。

1.8 分子对接 将Hub基因导入Uiprot数据库，设置筛选条件。种类：Homo Sapiens，状态：Reviewed，获得蛋白结构，输入RCSB PDB数据库获得Hub基因编码的蛋白结构，并使用Pymol 2.6.0软件去除水分子和小分子；从PubChem数据库获得SYD主要活性成分的2D结构式，使用Open Babel GUI 2.4.1软件将2D结构式转换3D mol2格式；将大分子和SYD主要活性成分分别导入AutoDockTools 1.5.6加氢，并设置为受体及配体；使用半柔性对接，导入大分子和SYD成分pdbqt文件，设置参数，Number of GA Runs：50，其余为默认参数进行对接，获得结合自由能。使用Pymol 2.6.0软件将对接结果可视化，构建分子对接模式图。

2 结果

2.1 SYD主要活性成分分析 通过LC-MS检测出SYD的化合物，其中正离子模式峰值比负离子模式峰值多，正离子模式检测出384种化合物，负离子模式检测出333种化合物，共717种化合物。（见图1～2）将SYD化合物的质谱数据与文献报道的质谱数据进行比对[10，19]，确定其名称、分子式、相对分子量、保留时间及质荷比等，共鉴定出18种主要活性成分。（见表1）

表1 芍药汤化学成分鉴定表

图1 正离子模式下的总离子流图

图2 负离子模式下的总离子流图

2.2 SYD活性成分靶点及CRC、IF靶点筛选 通过SwissADME数据库对SYD主要活性成分进行筛选，最终确定11种主要活性成分，分别为槟榔碱、没食子酸、3-甲基吲哚、小檗碱、桂皮醛、异甘草素、白杨素、芒柄花黄素、洋川芎内酯A、汉黄芩素、大黄素。11种主要活性成分经过SwissTargetPrediction数据库预测，去重后共获得500个靶点基因。（见图3）通过GeneCards数据库、OMIM数据库及TTD数据库分别获得CRC靶点基因1122个，IF靶点基因463个。

图3 SYD 成分-靶点图

2.3 PPI网络及Hub基因 将SYD、CRC、IF的靶点基因取交集，共获得31个交集靶点，并构建Venn图。（见图4）将31个交集靶点通过String数据库进行蛋白互作分析，拓朴分析得出共有31个节点、231条边，平均节点度值为14.9。（见图5）。通过cytoHubba插件，最终获得6个Hub基因，为ALB、TNF、IL1B、MMP9、PTGS2、PPARG（见图6），对应8种活性成分，为没食子酸、芒柄花黄素、小檗碱、白杨素、大黄素、异甘草素、汉黄芩素、洋川芎内酯A。

图4 SYD、CRC 与IF 交集靶点Venn 图

图5 PPI 网络图

2.4 富集结果分析 KEGG富集主要涉及癌症通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路等前20条通路。（见图7～8）。根据KEGG富集分析获得前20条信号通路，以及对应关键靶点、活性成分，构建出药物-成分-疾病-菌群-靶点-通路的网络图。（见图9）前10条GO-BP功能分析主要包括炎症反应调节、防御反应调节、细胞内信号转导负调控等生物学过程；前10条GO-CC功能分析主要包括转录调节复合物、核膜及蛋白激酶复合物等细胞组分；前10条GO-MF功能分析主要包括血红素结合、四吡咯结合、雌激素2-羟化酶活性等分子功能。

图7 KEGG 富集分析气泡图

图8 GO 富集分析柱状图

图9 药物-成分-疾病-菌群-靶点-通路图

2.5 分子对接结果 将6个Hub基因及对应8种主要活性成分进行分子对接，共对接15次。其结合自由能值越低，结构越稳定，发生相互作用越大。分子对接结果显示：SYD活性成分与Hub基因结合自由能均低于-4 kcal/mol，其对接结果较好，具有一定的可信度。（见表2）将结合自由能最低值导入Pymol 2.6.0软件进行可视化。（见图10）

表2 分子对接结果

图10 分子对接图

3 讨论

CRC在中医学中属“肠蕈”“脏毒”“肠风”“痢疾”“锁肛痔”“便血”等范畴。芍药汤“下血调气。经曰：溲而便脓血，气行而血止，行血则便自愈，调气则后重自除。”（《素问病机气宜保命集·卷之中》）症状与现代医学CRC的黏液鼻涕样血便有着相似之处。CRC发病机制通常与信号通路相关，如Wnt信号通路[20]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）通路[21-22]、法尼醇X受体（farnesoid X receptor，FXR）信号通路[23]、NF-κB信号通路[24]等。杜怀棠认为CRC的病机与“气”密切相关，正气亏虚，气机紊乱，毒结留滞是致病之源；气滞、痰凝、血瘀、毒结，胶结留滞肠道，壅聚不散，日久生积是CRC产生的基础[25]。刘完素以“行血调气”为法，创立芍药汤，此方用大黄之荡涤邪滞，木香、槟榔之理气，当归、肉桂之行血；病多因湿热而起，故用黄芩、黄连之苦寒以燥湿清热；用芍药、甘草，缓其急而和其脾。全方配伍，以清热燥湿为主，兼以调和气血，用于防治CRC。

本研究采用LC-MS技术结合网络药理学的方法，筛选出SYD调控IF防治CRC的活性成分、关键靶点及主要通路。SYD、CRC和IF交集靶点基因中的ALB、TNF、IL1B、MMP9、PTGS2、PPARG为Hub靶点基因，其对应8种主要活性成分。其中小檗碱可以减少炎症相关性结直肠癌小鼠的肿瘤数量，并重塑小鼠中致病菌和有益菌的组成。小檗碱能增加粪便丁酸、乙酸和丙酸水平，但不改变异丁酸、异戊酸、戊酸和己酸。此外，小檗碱能降低结肠炎相关结直肠肿瘤发生小鼠粪便中脂多糖的含量。小檗碱可以通过TLR4/p-NF-κB p65/IL-6/p-STAT3炎症-癌症转化通路抑制炎症相关性结直肠癌[26]。没食子酸可以逆转环境压力导致肠道微生物群和代谢紊乱，显著降低幼犬腹泻的发生率并减轻多种环境应激源引起的氧化应激和炎症反应[27]。芒柄花黄素可能是一种潜在的益生元，可以有效调节肠道微生物群，改善宿主代谢和全身炎症，并能通过提高醋酸乳酸和乳酸丁酸的产生来预防饮食的有害影响[28]。白杨素能够干扰果糖对肠道的影响水平，增加大鼠肠道中的厚壁菌门与拟杆菌门的比例，这可能有助于治疗果糖诱导的代谢综合征[29]。大黄素可以增加粪便中的乳酸杆菌，通过调节肠道细菌和肠道干细胞发育，减轻结肠炎症，并能抑制沙门氏菌感染引起的杯状细胞损失[30]。异甘草素能降低大肠杆菌和肠球菌等病原体，升高菌群中普氏菌属、丁酸杆菌属、梭菌属和瘤胃球菌的丰度，从而抑制大肠癌的发展[31]。汉黄芩素等黄酮类提取物可以在病理状态下增加肠道菌群的生物转化能力，通过抑制体内补体系统的过度激活来改善甲型流感病毒（IAV）诱导的小鼠急性肺损伤（ALI）[32]。洋川芎内酯类化合物在抗氧化损伤、抗炎、抗凝血、抗动脉粥样硬化、抗脑缺血再灌注损伤等方面有较好的应用前景[33]。8种SYD主要活性成分均具有调节IF的作用，因此，SYD能够改善肠道中菌群种类和丰度。

在CRC发生过程中，次级胆汁酸水平升高能通过多种机制对结肠上皮的结构和功能产生有害影响，包括NF-κB信号通路的激活、DNA的氧化损伤和结肠细胞的过度增殖[34]。此外，食物在肠道中可以被微生物发酵为短链脂肪酸——乙酸、丙酸和丁酸等，它们对肠道免疫至关重要。其中丁酸梭菌菌体可下调IL-17信号通路、TNF信号通路等炎症相关通路，从而缓解炎症[35]。KEGG富集分析显示，SYD防治CRC的通路与上述通路基本一致，其中ALB、TNF、IL1B、MMP9、PTGS2、PPARG靶点均可参与到炎症反应中[36-39]，表明SYD可能通过调节IF，参与相关炎症通路（如IL-17、TNF、NF-κB等），发挥防治CRC的功效。但SYD防治CRC与IF的作用机制，还需进一步实验验证。