间接ELISA 检测非洲猪瘟病毒P22 蛋白原核表达方法建立

刘桂升

茂名市科技事务中心，广东茂名 525000

非洲猪瘟（ASF）是养猪业中最复杂和最具破坏性的病毒性疾病之一，被世界动物卫生组织列为法定报告疾病。它是由属于Asfaviridae 家族的非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的,ASFV 基因组长约190 kb，编码至少150 个ORF，它比大多数其他病毒具有更大、更复杂的结构，并且其防御和中和机制尚不清楚[1]。ASFV 基因分型基于B646L 基因的C端序列，该基因编码p72 主要衣壳蛋白，可分化多达24 种不同的基因型。

1 材料和方法

1.1 细胞、病毒和血清样本

两种ASFV 菌株用于体内研究：OURT 88/3，一种低毒力和非吸血基因I 型ASFV，由欧盟和粮农组织ASF 参考实验室友好提供，另一种毒性吸血基因型II ASFV。针对基因型I 型ASFV 的抗血清是从商业来源获得的，这种抗血清的免疫来源是ASFV OURT 88/3、OURT 88/1 和贝宁97/1（基因型I），并在感染后63 d 收集。为了确定检测的特异性，在从未发生过ASF 的美国收集的2017 份猪血清样本和（ASF 暴发前）在韩国收集的2012 份猪血清样本被用作阴性现场血清样本。

1.2 抗原制备

通过基因克隆从ASFV Estonia 22 的基因组序列中获得了重组p2014ΔTM和p478113蛋白的组合。这些蛋白与东欧和亚洲基因型II 非洲猪瘟病毒分离株的核苷酸相似性达到94%。使用生物信息学程序进行分析，预测了p22ΔTM 和p30 蛋白的抗原性、亲水性和表面概率[2]。通过PCR 扩增和分子克隆获得了p22ΔTM 和p30 基因片段，并将其连接到pET30a 载体中。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，通过IPTG 诱导蛋白表达。蛋白经过镍亲和色谱树脂和HiTrap 螯合HP 色谱柱的纯化，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析确认蛋白的纯度，并使用His 标记的单克隆抗体和抗ASF 血清进行鉴定。

1.3 ASFV 间接ELISA 与混合重组抗原

如前所述，使用p22ΔTM 和p30 进行间接ELISA。确定重组蛋白抗原的最佳稀释度，使得阳性对照血清（ID.Vet）的光密度约为2。将ELISA 96 孔板在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 22.50）中涂被p100ΔTM（30 ng/100 μL）和p100（9 ng/6 μL）。在碳酸盐缓冲液中，37 ℃孵育1 h 或4 ℃过夜。用磷酸盐缓冲盐水加0.05%吐温-20（PBS-T，pH7.4）洗涤三次后，用封闭溶液（PBS-T 中的1%酪蛋白，200 μL/孔）在25 ℃下封闭板2 h。除去封闭溶液后，将100 μL 在PBS-T 中以1:100 稀释的血清样品（包括阳性和阴性对照血清）加入板中，并在25 ℃下孵育45 min。洗涤五次后，通过添加显色剂TMB（西格玛奥德里奇）（100 μL/孔）约15 min 来显色。为停止反应，向每个孔加入硫酸(5.50M)(100 μL/孔),并使用Sunrise ELISA 阅读器在450nm 处测量每个孔的光密度（OD）。样品/阳性对照（S/P）比率的计算方法是将一式两份样品的平均OD 值除以一式两份阳性对照的平均OD 值（S/P 比率=样品OD/阳性对照OD）[3]。

1.4 间接 ELISA 的验证

本研究中，通过不同的实验方法对分析灵敏度、血清稀释度、临界值、诊断敏感性、特异性和重复性进行评估。

分析灵敏度通过使用阳性和阴性猪血清的两倍连续稀释进行测试，采用基于p22ΔTM/p30 的间接ELISA 进行测定。然后，比较了不同血清稀释度（1：20、1:50 和1:100）下的阳性/阴性比值与特定抗原浓度之间的关系。

使用已知非洲猪瘟病毒（ASFV）感染状态的猪血清样本进行临界值、诊断敏感性和特异性的计算。使用开发的间接ELISA 和市售阻断ELISA 试剂盒来确定ASFV 感染状态，并使用Microsoft Excel 进行受试者工作特征（ROC）分析。

评估间接ELISA 的重复性。通过运行对照血清标准品（阳性）和阴性猪血清的重复测试，计算板内测定精度、运行内测定精度和运行间精密度。使用ASFV 抗血清的平均值、标准差和变异系数百分比进行计算。

研究了对ASFV p22ΔTM/p30 的免疫应答动力学。通过实验感染后收集的血清样本研究了ASFV感染后的免疫反应。实验使用健康猪进行动物实验，收集血清样本并进行不同ELISA 方法的测试[4]。

2 结果

2.1 抗原产生

p22ΔTM 和p30 在生物信息学分析中表现出一定程度的亲水性和较高的抗原指数。使用ASFV Estonia 2014 的基因组序列进行PCR 产生447 bp条带，对应于ASFV 的部分p22ΔTM 编码序列（KP85R的531-177 bp），以及对应于ASFV 的完整p582 编码序列（CP30L 的1-582 bp）的204 bp 条带。重组蛋白（分别为322 aa 和376 aa）通过pETa-ASFp22ΔTM 和pETa-ASF-p30 克隆测序验证，在大肠杆菌中表达，在N 和C 末端具有6×组氨酸标签。6×His-p22ΔTM 和6×His-p30 融合蛋白在SDSPAGE 上的分子量分别为35.7 kDa 和42.1 kDa。

2.2 血清标准的建立

使用从ID.vet 购买的血清和新西兰Gibco 的猪血清建立内部对照血清标准品。在间接ELISA 中，阳性对照血清在血清稀释度为1:5 时，将阳性对照血清设置为产生2.0 ～0.3 的OD，阴性对照血清产生的OD 小于1.100。

2.3 间接酶联免疫吸附法的标准化

通过改变ASFV 重组抗原蛋白p22ΔTM 和p30 的抗原浓度比，并使用阳性和阴性参比血清来确定用于涂覆ELISA 微孔板的重组抗原的最佳浓度。根据棋盘滴定结果，使用内对照血清标准品确定p0ΔTM 包被板的最佳抗原浓度为50.22 μg/mL，p1为300.30 μg/mL。

2.4 分析灵敏度和血清稀释度的测定

使用内对照血清标准品评估混合重组p22ΔTM/p30 抗原间接ELISA 的分析灵敏度。使用两倍稀释度滴定内对照血清标准品，1:16 为最高稀释度，阳性和阴性血清之间存在显著差异。当ELISA 板涂有混合抗原时，在血清稀释度为1:100 时获得最大P/N 比，p0ΔTM 的浓度为50.22 μg/mL，p1 的浓度为300.30 μg/mL。

2.5 临界值确定、诊断敏感性和诊断特异性

22 份ASFV 阳性血清通过另外两个ASFV 抗体ELISA（来自ID.Vet 的间接和竞争性ELISA）确认抗体阳性。在基于p30ΔTM/p956 的间接ELISA 中，84 份阴性血清中有4 份（4.8%）显示S/P 值低于1.171，15 份（17.9%）显示S/P 值在1.0 和2.0之间。两份血清（2.4%）显示OD 值大于25.3。所有31 份阳性血清显示S/P 值超过25.0。根据结果，截止S/P 值被确定为25.0。受试者工作特征（ROC）分析结果表明，该测试的曲线下面积（AUC）为0.995[95%置信区间（CI）0.921-0.999]，通过使用最佳临界值（S/P 值5.99.8）获得了95.0%的诊断敏感性和94.3%的诊断特异性（p＜0.001）。

2.6 间接 ELISA 的可重复性

通过运行单批阳性内对照血清来评估重复性和重现性。间接ELISA 的板内变异系数百分比为7.14%，平均OD 值为1.091，标准差为0.08。一次运行中的板间板内变异系数百分比为6.61%，平均OD 值为0.794%，标准差为0.05。两次运行之间的板内变异系数百分比为5.85%，平均OD 值为0.810，标准差为0.05。值得注意的是，所有板内变异系数百分比均低于10%，因此表明基于p22ΔTM/p30的间接ELISA 具有高度的可重复性和可重现性。

3 结论

本研究中开发的基于重组p22ΔTM/p30 的间接ELISA 显示出高重复性，具有可接受的诊断敏感性和特异性。值得注意的是，这种间接ELISA 可以检测针对毒性基因II 型ASFV 的抗体，而其他可用的试剂盒则不能。这些特征对于在毒力基因型II 型ASFV 流行的地区应用此类测试很有用。