日本乙型脑炎病毒蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展

袁盛林,汤德元,陈阊峥,罗 柳,陈 旭,廖正波

(贵州大学 动物科学学院, 贵州 贵阳 550025)

日本脑炎(JE)是由蚊媒传播的日本脑炎病毒(JEV)引起的,为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科黄病毒属人畜共患病病原[1-2]。是亚洲病毒性脑炎的主要原因,其RNA基因组约有11 kb,编码3种结构蛋白:衣壳蛋白(C)、膜蛋白(pr M/M)和包膜蛋白(E),以及7种非结构(NS)蛋白:NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5,它们被翻译为前体多蛋白[3]。JE是人类最常见的地方性脑炎之一,在动物中也时常发生,尤其是在整个南亚地区、东南亚地区、俄罗斯东部地区、澳大利亚的一些地区、西太平洋岛屿(塞班岛)和巴布亚新几内亚[4]。严重乙脑的临床特征是高烧、头痛、颈部肌肉僵硬、定向障碍、癫痫、瘫痪、昏迷,最终死亡。任何年龄的人群均能感染JE,但儿童更易感[5-6]。目前认为对于JE最有效的方法是免疫预防,现在有4种类型的JEV疫苗已被批准用于大规模免疫:分别是减毒活疫苗SA14-14-2、灭活小鼠脑源性疫苗、灭活Vero细胞培养疫苗和减毒嵌合疫苗[7]。尽管这些疫苗非常有效,但乙脑病例的发病率仍在增加[8],这表明需要建立治疗乙脑感染的新疗法。在病毒感染过程中,宿主蛋白和病毒的蛋白相互作用对病毒的吸附、穿入、复制及病毒感染等有着密切的相关性,了解这些作用对于JEV的防制具有十分重要的作用。本文将近年来有关JEV蛋白和宿主蛋白之间的相互作用机制进行综述,为后续相关领域研究提供参考。

1 JEV结构蛋白与宿主蛋白的相互作用

1.1 衣壳蛋白C与宿主蛋白的相互作用JEV C蛋白包含100个氨基酸残基,具有富含螺旋的结构,并与其他黄病毒形成相似的稳定同源二聚体[9],在黄病毒生物学中起着至关重要的作用,这种多功能蛋白可能会成为新的抗病毒药物开发的目标。在病毒生命周期中,C蛋白亚基组装形成核衣壳,而病毒核酸是由衣壳包裹。除了这种经典的结构作用之外,C蛋白与病毒复制周期中的其他重要功能也密切相关[10]。宿主对C蛋白的酶活性也可能影响毒力,根据对JEV的研究,宿主蛋白酶组织蛋白酶L在高度保守的残基Lys18、Arg19和C蛋白之间相互作用,切割C蛋白才能使病毒正常复制。另外衣壳C蛋白与几种宿主蛋白相互作用,包括和相关蛋白6 (DAXX)诱导细胞凋亡,以及与核心组蛋白作用后通过破坏核小体介导转录[11]。除存在于细胞质中外,JEV C蛋白还可被核定位序列引导转运到细胞核中并指导病毒复制。C蛋白的核定位与核仁磷蛋白B23密切相关,它们相互作用的关键位点是C蛋白的核定位基序。该基序突变导致C蛋白无法与B23结合,最终C蛋白定位不准确导致病毒复制受到抑制。另外Jab1是COP9信号体(CSN)复合体的第5个亚基,Jab1可通过结合病毒C蛋白并调节C蛋白的降解来参与病毒的复制。JEV C蛋白还通过与Caprin-1蛋白结合来抑制应激颗粒SG的形成,促进病毒复制和翻译[12]。

1.2 膜蛋白pr M/M与宿主蛋白的相互作用JEV pr M蛋白主要存在于不成熟的病毒中,是M蛋白的前体蛋白。研究表明pr M/M和E蛋白在黄病毒的进入、组装和分泌中发挥重要作用[13],并且pr M蛋白可能与E蛋白的装配、折叠以及定位等有关。病毒中的pr M/M蛋白保守区域主要参与病毒颗粒的组装和分泌,DE WISPELAERE等[14]研究发现该区域被取代后会导致病毒的分泌减少。病毒在感染宿主时pr M蛋白会被细胞的furin蛋白酶切割成非糖基化的M蛋白和糖基化的pr蛋白肽,M蛋白仅与pr M的C末端有关,参与病毒感染过程。被furin蛋白酶切割的pr M会产生感染性颗粒,含有未切割pr M的未成熟颗粒不能进行膜融合并释放到细胞外环境。但是furin蛋白酶介导的pr M蛋白裂解通常是不完全的,可以检测到未成熟、部分成熟和成熟的细胞外颗粒的混合物,平衡的分解会影响病毒的复制或毒力[15]。目前为止对于pr M/M蛋白与宿主蛋白相互作用的了解仅有被furin蛋白酶切割,要了解得更深入尚需进一步研究。

1.3 E蛋白与宿主蛋白的相互作用JEV是通过内吞作用进入宿主细胞,所以病毒粒子的表面包膜(E)蛋白在介导病毒包膜与内体膜在低pH值下融合的过程中起核心作用[16]。研究表明E蛋白与黄病毒进入、组装和释放密切相关。硫酸乙酰肝素、非整联蛋白 DC-SIGN(CD209)和非整联蛋白 L-SIGN(CD209L)作为病毒黏附因子,可以通过与病毒E蛋白相互作用介导病毒的入侵和感染[17]。在进入和释放宿主细胞期间,E蛋白要经历广泛的构象变化。在JEV中,E蛋白有3个结构域DⅠ、DⅡ和DⅢ,DⅠ和DⅢ之间的保守组氨酸(His323)是关键的pH传感器,His323的质子化能引发E蛋白的大规模构象重排以及病毒和内体膜的融合。包膜E蛋白是一种典型的Ⅱ类膜融合蛋白,与M蛋白一起通过跨膜螺旋锚定到脂质双层包膜上形成病毒颗粒的外壳,通过其构象的重排融合病毒和内体膜从而形成一组蛋白质三聚体,其中融合肽(FP)与内体膜相互作用引发融合[18]。已经有研究表明,E蛋白与JEV等黄病毒的毒力密切相关,当JEV中的E蛋白发生突变会减弱病毒毒力。在BHK细胞中,JEV E蛋白被证实可与糖胺聚糖相互作用,而糖胺聚糖与蛋白的结合可促进病毒吸附和感染。另外葡萄糖调节蛋白78 (GRP78)是已被确定为与哺乳动物细胞中JEV E蛋白DⅢ区域(ED3)相互作用的宿主蛋白,在病毒感染细胞后两者相互作用共同调节病毒复制,还参与其向质膜的转运,但确切的机制尚不清楚[19]。另外DAS等[20]用生物信息学软件预测E蛋白的RGD区与Neuro2A 细胞上热激蛋白Hsp70的539位的亮氨酸可形成稳定的相互作用状态,表明Hsp70可以作为Neuro2A细胞上JEV的受体,由此可见E蛋白与宿主蛋白相互作用在病毒感染过程中扮演了重要角色。

2 JEV非结构蛋白与宿主蛋白的相互作用

2.1 NS1蛋白与宿主蛋白的相互作用JEV NS1蛋白是病毒复制中的关键蛋白,NS1作为单体或膜结合蛋白位于细胞膜中,在细胞质中或作为六聚体(分泌蛋白)位于细胞外。细胞内NS1是病毒复制中的关键保守蛋白,是合成正链和负链病毒RNA以及形成内质网相关复制复合体所必需的,在诱导宿主免疫应答中也具有重要作用。病毒复制过程中与多种宿主分子相互作用,从而帮助病毒复制、翻译和病毒粒子增殖等[21- 22]。WANG等[23]研究表明,在JEV感染时NS1主要与波形蛋白、异质核核糖核蛋白K(hnRNP K)相互作用后促进病毒复制,并且NS1与细胞波形蛋白和hnRNP K共定位,在病毒生命周期中有重要的作用。NS1发生核糖体-1移码时会产生NS1′,对病毒增殖也有重要作用。HAX1蛋白即造血和淋巴细胞限制性细胞内蛋白HS1相关蛋白X1,是一种具有多种功能泛素化表达的蛋白。其功能与细胞生存力,细胞迁移和控制癌症进展有关,病毒感染时NS1可与HAX1的203～279aa区域发生互作,在病毒的生命过程中发挥作用,但具体的作用机制还有待进一步研究[24]。

2.2 NS2A蛋白与宿主蛋白的相互作用JEV NS2A为疏水跨膜蛋白,主要参与JEV复制,还与病毒组装密切相关[25]。NS2A 166位氨基酸对JEV的体外增殖和组织嗜性有重要作用[26]。三基序(TRIM)蛋白通过其E3连接酶活性直接降解病毒蛋白或通过促进宿主先天免疫间接发挥其抗病毒活性,参与各种细胞过程并在宿主抗病毒功能中发挥重要作用。TRIM52是一种新型抵抗JEV感染的TRIM蛋白。FAN等[27]研究表明TRIM52可通过与JEV NS2A 直接的物理相互作用并诱导NS2A泛素化,通过蛋白酶途径导致NS2A降解从而抑制病毒增殖。目前和NS2A相互主要的宿主蛋白研究较少,但TRIM52和NS2A相互作用能抑制病毒增殖,可见NS2A有可能成为降低JEV感染的新方向。

2.3 NS2B蛋白与宿主蛋白的相互作用JEV NS2B蛋白是一种跨膜蛋白,与翻译后蛋白质加工和病毒组装密切相关。NS2B作为NS3蛋白功能的辅助因子,通过促进蛋白酶活性来加工基因组编码的多蛋白,可与自身和包括NS2A、NS4A、NS4B、NS3蛋白,以及和其他膜蛋白相互作用[28]。信号肽酶复合物亚基1 (SPCS 1)是微粒体信号肽酶复合物的一个组成部分,负责切割许多分泌蛋白和膜相关蛋白的信号肽,对翻译后蛋白质加工和病毒组装十分重要,之前有报道SPCS 1对于JEV的复制是必不可少的[29]。MA等[30]首次证明宿主因子SPCS 1与JEV NS2B蛋白的两个跨膜结构域NS2B(1～49)和NS2B(84～131)相互作用影响病毒复制。参与黄病毒的病毒粒子组装出芽和释放到内质网(ER)腔,从而影响JEV蛋白的翻译后加工和病毒粒子的组装。但病毒组装过程的细节复杂,要完全了解还需要更多的研究。

2.4 NS3蛋白与宿主蛋白的相互作用JEV的非结构蛋白3 (NS3) 是一种具有619个氨基酸残基的多功能蛋白,在病毒前体多蛋白的加工和病毒基因组RNA的复制中起重要作用。在JEV感染的细胞中NS3与微管和肿瘤易感基因101蛋白相关,在病毒RNA包装、病毒成分的细胞内运输和病毒组装中起重要作用[31]。 NS3蛋白与核受体结合蛋白(NRBP)特异性作用,在核内共定位并影响病毒复制。白细胞介素增强子结合因子2 (ILF2)是一种组成型表达并定位于细胞核的染色质相互作用蛋白。ILF2与白细胞介素增强子结合因子3 (ILF3)形成稳定的异二聚体,并在细胞核中T细胞活化期间调节IL-2基因的转录,ILF2和ILF2/ILF3复合体是参与microRNA生物合成、RNA转录、剪接、mRNA翻译、DNA断裂修复、细胞增殖和凋亡的重要调节因子[32-36]。ILF2也是一种重要的参与病毒复制过程的宿主细胞蛋白[37-38]。CUI等[39]研究表明在JEV感染过程中,NS3蛋白与ILF2相互作用,并且这种相互作用不是由DNA或者RNA介导的,共同参与JEV生命周期并抑制JEV复制。另外JEV NS3是一种多功能蛋白,也能与JEV NS2B和NS4A相互作用,起解旋酶、蛋白酶和核苷三磷酸酶的作用,与NS5和dsRNA一起形成病毒复制酶复合物,并在病毒复制和病毒组装中发挥重要作用[40-42]。

2.5 NS4A蛋白与宿主蛋白的相互作用JEV NS4A蛋白是一种高度疏水的16 kDa跨膜蛋白,在病毒复制中起着至关重要的作用,其与病毒复制复合物定位有关,可诱导宿主膜改变[43]。NS4A和细胞波形蛋白中间丝之间的相互作用促进复制复合物(RC)的形成。NS4A也可与两种定位在线粒体中的宿主蛋白相互作用,其中一种蛋白质是PTEN诱导的激酶1(PINK 1),另一种是以其在线粒体自噬中的作用而闻名的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。病毒感染会导致PINK 1表达下调,有丝分裂吞噬通量增加同时线粒体质量下降,干扰JEV诱导的线粒体片段化和有丝分裂限制病毒繁殖[44]。病毒感染哺乳动物细胞期间,JEV非结构蛋白NS4A在线粒体动力学中发挥重要作用。JEV NS4A和PINK 1相互作用可能在JE相关的神经病理学中发挥重要作用,然而这种相互作用对乙脑疾病表现的确切影响需要进一步的研究来阐明。

2.6 NS4B蛋白与宿主蛋白的相互作用JEV NS4B是一种小的完整膜蛋白(约27 kDa),ER应激传感器蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)在急性或长期ER应激下诱导细胞凋亡,主要与PERK发生互作。NS4B具有的基序包括LIG-SH2(氨基酸(aa)64～67)、LIG-FHA(aa 162～168和aa 192～198)、LIG-WD40(aa 7～12、aa 31～36、aa 197～216和aa 249～253),可分别结合PERK内的SH2结构域、FHA结构域和WW结构域。且NS4B中的LIG-FHA和LIG-WD40结构域都需要诱导PERK二聚化,说明JEV NS4B是通过不同的基序同时与它们相互作用将两个PERK分子拉到一起,PERK失活可减少JEV感染期间的脑细胞损伤和脑炎。此外,在小鼠Neuro-2a细胞中JEV NS4B的表达会使PERK诱导脑炎,表明JEV主要通过其NS4B激活PERK引起脑炎[45]。可见对于JEV引起的脑炎可通过诱导PERK失活从而得到缓解,这将有可能成为治疗JEV引起脑炎的一种新型治疗方法。

2.7 NS5蛋白与宿主蛋白的相互作用在非结构蛋白中,黄病毒的NS5在先天免疫逃避中起关键作用。NS5是最大的黄病毒蛋白,含有N端甲基转移酶(MTase)和C端聚合酶RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp),分子内NS5具有完整的MTase和RdRp界面,由两部分组成:六残基疏水网络和GTR接头[46]。MTase-RdRp界面和GTR接头区域是RdRp延伸、起始和黄病毒复制所必需的[47]。PRYOR等[48]研究表明输入蛋白α/β(importin α/β)与NS5在核内共定位影响病毒的复制。另外NS5和末端顺式作用RNA之间的合作控制线性和环状基因组构象的平衡,并允许有效的病毒复制[49-51]。WANG等[52]通过酵母双杂交法筛选小鼠脑cDNA文库,发现JEV NS5蛋白可与HSP40的同源蛋白Hdj2相互作用,对病毒复制起到积极的调控作用。KAO等[53]研究表明JEV NS5与羟酰基辅酶A脱氢酶α(HADHα)和羟酰基辅酶A脱氢酶β(HADHβ)相互作用,HADHα和HADHβ是参与LCFA β氧化的酶复合物MTP的两个亚基。这种相互作用损害了LCFAβ氧化,增加了细胞因子的产生,并促进JEV的发病机制。NS5的M19残基参与其与MTP的相互作用,与野生型JEV相比,具有NS5-M19A突变的重组JEV更不能阻断LCFAβ氧化,诱导更低水平的细胞因子产生,并表现出更低的神经毒性和神经侵袭性。

3 小结与展望

JE在全球的广泛传播已经对世界各国的畜牧业和人类健康造成了严重的危害。同时,由于其致病机制十分复杂,具有持续性感染的典型特征,使其防治极其困难。研究表明,JEV蛋白与宿主细胞蛋白相互作用,对病毒入侵、复制、胶质细胞增殖、神经元凋亡、炎性反应、IFN抵抗与诱导宿主保护性免疫等均有重要影响。因此,分析JEV与宿主蛋白的相互作用不仅对其致病机制的研究至关重要,而且为新型抗病毒药物和新型疫苗的研究提供了新的思路。病毒蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用是介导病毒进入细胞内引起动物机体感染的关键。蛋白质作为生命活动的主要承担者,各种复杂的生命活动都离不开蛋白质的参与,但人体的大部分生命活动不能仅仅依靠单一的蛋白质调节,必须依靠蛋白质之间的相互作用才能维持机体正常的生命活动,因此研究蛋白质之间的相互作用就显得尤为重要。对于一些研究背景不明确的蛋白质,可以研究其相互作用蛋白的功能及其对生物体的影响,分析靶蛋白的相关作用,为未知蛋白质的研究提供思路。目前,虽然国内外学者对JEV的研究取得了一定进展,但由于病毒与宿主细胞相互作用的复杂性,对其具体致病机制的了解仍然有限。与同属病毒相比,仍有巨大的研究空间。本文从蛋白相互作用的角度出发,综述了与JEV蛋白相互作用的宿主蛋白以及病毒感染宿主的致病机制,可为JE病的诊断、防制提供一定的参考。