微生物菌剂对成苗期及伸根期烟苗生长发育的影响

毛 敏，叶田会，石松柏，冯文龙，白加林，王雪峰 ，刘钰彤，王程栋，况 帅，许 娜

（1.四川省烟草公司攀枝花市公司，四川 攀枝花 617000；2.中国农业科学院烟草研究所/农业农村部烟草生物学与加工重点实验室，山东 青岛 266101；3.青岛农业大学农学院，山东 青岛 266109）

【研究意义】微生物菌剂是由一种或多种有益微生物、培养基质和添加剂配制而成的新型生物肥料，其可通过改善土壤理化性状来稳固及释放土壤中的氮、磷、钾和有机质等养分，从而促进植物生长和提高植物抗性［1-3］。微生物菌剂的施用是实现减肥增效、化肥零增长的重要途径，是农业可持续发展和构建生态农业的必然需求［4-5］。【前人研究进展】目前，在土壤中施入具有活性的微生物菌剂已成为改善土壤微生物群落的重要手段。在土壤或者有机肥中添加微生物菌剂可显著增加土壤中细菌数量，土壤微生物可以促进土壤物质循环及土壤中的养分物质吸收，因此，土壤微生物是土壤肥力提升的重要保障，也是改善土壤理化性质的重要手段［6-7］。左应梅等［8］研究表明，微生物菌剂的施用可有效提高三七的抗病性，促进其生长发育和干物质量积累。陈敏洁等［9］研究发现，隶属于芽孢杆菌属的Bacillus pumilus菌与化肥配施可以显著增加油麦菜株高、鲜重及干质量，促进其吸收养分。微生物菌剂的施用可通过改善植烟土壤养分含量、提高碳循环和氮循环能力来促进植物对土壤养分的吸收，还可通过影响植物体内和植物根际土与非根际土中微生物的数量等方式有效提高烤烟的株高、茎围、腰叶长度等［10-11］。此外，微生物菌剂还可以缓解烤烟连作障碍并提升其抗病性［12-13］。【本研究切入点】暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）也称为西姆芽孢杆菌［14］，具有促进植物生长、减少重金属在植物内累积、提升植物抗氧化能力和抗病性等功能［15-17］。在烟草中，该菌可改善烟叶品质及拮抗烟草黑胫病菌［18］。霍氏假单胞菌（Pseudomonas rhodesiae）具有抑菌作用，但对植物生长的影响尚未见报道［19］。有研究指出，微生物菌剂可促进烟草种子萌发、烟苗生长发育及提升烟苗抗病性［20-21］。但B.siamensis和P.rhodesiae对烟苗生长及环境适应性是否有促进作用还未知。【拟解决的关键问题】本研究分别将暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensisEM-1）和霍氏假单胞菌（Pseudomonas rhodesiaeMTD4-1）添加至根际育苗基质中，研究其对烟苗根系发育、相关生理指标及成苗期根际育苗基质和烟苗根系微生物多样性的影响，旨在阐明两种菌剂促生机制，并为其在育苗生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021 年3 月在攀枝花市米易县黄龙村育苗棚中进行，供试烤烟品种为云烟87，由四川省烟草公司攀枝花市公司提供。菌剂Bacillus siamensisEM-1（21131）和Pseadomonas rhodesiaeMTD4-1（20079）均来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

1.2 试验设计

采用托盘（72 孔育苗盘）育苗，设置3 个处理，每个处理3 个重复。CK：常规育苗基质；EM-1：育苗基质添加1×107CFU/g 菌剂 EM-1；MTD4-1：育苗基质添加1×107CFU/g 菌剂MTD4-1。试验于成苗期（烟苗达到移栽的壮苗标准，可进行移栽的日期）、伸根期（移栽到大田后30 d 内的时期）取样，每个处理从育苗盘中小心取出长势均一的烟苗3 株，将根系洗净，装入封口袋，用冰盒将样品带回实验室进行各指标检测。

1.3 测定项目及方法

微生物多样性测定：使用高通量测序技术测定成苗期烟苗根系及对应育苗基质中的微生物多样性和群落分布［22］。对测序得到的原始数据进行拼接、过滤，可得到有效数据（Clean Data）；基于有效数据通过DADMTD4-1 进行降噪，并过滤掉丰度小于5 的序列，从而获得最终的特征序列（对应于OTU 代表序列）。基于得到的OTU序列，对每个代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况；对OTU 进行丰度、Alpha 多样性计算等分析，得到样本内物种丰富度和均匀度信息等。

干物质测定：将烟苗的根系从根茎接合处断开，将根系周围的育苗基质或土洗净后，根系和地上部（茎和叶）样品分别放在牛皮纸上，烘箱设定105 ℃杀青30 min 后转为65 ℃烘干至恒重，电子天平称量。

根系性状测定：将烟苗的根系从根茎接合处断开，将根系周围的育苗基质或土洗净后，将根系在蒸馏水中拆解开，保证样品之间没有重叠，使用EpsonExpression 11000XL 进行扫描，用WinRHIZO 软件分析总根长、根总表面积、根直径及根总体积［23-24］。

烟苗农艺性状测定：利用卷尺测定烟苗的高度、最大叶长、最大叶宽，用游标卡尺测定烟苗茎直径。

根系活力测定：将烟苗的根系从根茎接合处断开，将根系周围的育苗基质或土洗净后，快速使用TTC 法测定根系活力［25］。

色素含量测定：称取约0.1 g 新鲜叶片，快速剪成细丝，浸没在10 mL 96%乙醇中置于暗处24 h，在665、649、470 nm 波长下采用赛默飞Multiskan SkyHigh 全波长酶标仪测定吸光值，根据实际叶片重量及吸光值计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量［26］。

2 结果与分析

2.1 微生物菌剂对成苗期根际育苗基质及烟苗根系微生物多样性的影响

由图1 可知，成苗期根际育苗基质和烟苗根系微生物多样性指数均为EM-1 ＞MTD4-1 ＞CK，且根际育苗基质中的微生物多样性高于烟苗根系。EM-1 处理根际育苗基质微生物多样性指数显著高于CK，与CK 相比增幅9.40%。EM-1处理烟苗根系微生物多样性指数显著高于CK 和MTD4-1 处理，增幅分别为34.70%和22.9%；MTD4-1 处理烟苗根系微生物多样性指数显著高于CK，增幅为9.59%。

图1 成苗期根际育苗基质及烟苗根系的微生物多样性指数Fig. 1 Microbial diversity index of rhizosphere seedling substrate and tobacco seedlings root at seedling stage

对根际育苗基质和烟苗根系微生物群落中丰度前十的菌群进行分析，结果（图2）表明，根际育苗基质和烟苗根系微生物群落丰度明显不同。根际育苗基质中，与对照相比，EM-1 和MTD4-1处理的金黄杆菌属（Chryseobacterium）相对丰度降低；而丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、伯克氏菌目（Burkholderiales）和热单胞菌属（Thermomonas）相对丰度增加；黄杆菌属（Flavobacterium）和其他菌属的相对丰度仅在EM-1 处理中增加；根瘤菌属（Rhizobium）、链霉菌属（Streptomyces）和假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度仅在MTD4-1 处理中增加。烟苗根系中，与对照相比，EM-1 和MTD4-1 处理的热单胞菌属（Thermomonas）和其他菌属相对丰度增加；EM-1 处理金黄杆菌属（Chryseobacterium）、微单胞菌属（Parvibium）和假单胞菌属（Pseudomonas）的相对丰度仅在EM-1 处理中增加。

图2 不同微生物菌剂对根际育苗基质及烟苗根系微生物群落属水平丰度的影响Fig. 2 Effects of different microbial agents on abundance of microbial communities at genus level in rhizosphere seedling substrate and tobacco seedlings root

2.2 微生物菌剂对烟苗根系发育的影响

由表1 可知，成苗期EM-1 处理根系干质量、总根长、根总表面积、根平均直径和根总体积显著大于CK 处理，增幅分别为70.00%、42.25%、58.08%、10.34%和75.47%；MTD4-1 处理根系干质量显著大于CK 处理，增幅为20%；EM-1 处理根系干质量、根总表面积、根平均直径和根总体积显著大于MTD4-1 处理，增幅分别为41.67%、32.07%、14.74%和51.22%。伸根期MTD4-1 处理根系干质量、总根长和根总表面积显著高于CK处理，增幅分别为50.00%、118.94%和65.89%；EM-1 处理总根长和根总表面积显著高于CK 处理，增幅分别为48.62% 和29.83%；MTD4-1处理根系干质量、总根长和根总表面积显著高于EM-1 处理，增幅分别为60.00%、47.31%和27.77%。烟苗成苗后移栽至大田30 d 内的时期为烟苗的伸根期，该时期是烟苗适应大田环境的关键时期，根系的发育情况可表征烟苗对环境适应性。由成苗期到伸根期，MTD4-1 处理根系干物质、总根长和根总表面积增幅均显著大于CK 和EM-1 处理。综上，相对于CK 处理而言，EM-1和MTD4-1 处理均有助于根系发育，EM-1 处理更有助于成苗期烟苗根系发育，MTD4-1 处理更有助于伸根期烟株根系发育。

表1 不同微生物菌剂对烟苗根系发育的影响Table 1 Effects of different microbial agents on root development of tobacco seedlings

2.3 微生物菌剂对烟苗地上部生长发育的影响

由表2可知，成苗期EM-1处理地上部干质量、苗高、茎直径、最大叶长和最大叶宽均显著大于CK 处理，增幅分别为36.27%、46.63%、33.56%、31.10%和37.97%；MTD4-1 处理苗高、茎直径、最大叶长和最大叶宽显著大于CK 处理，增幅分别为39.01%、18.21%、13.12%和17.07%；EM-1处理地上部干质量、茎直径、最大叶长和最大叶宽显著大于MTD4-1 处理，增幅分别为24.11%、12.98%、15.89% 和17.86%。伸根期MTD4-1 处理地上部干质量、苗高、茎直径、最大叶长和最大叶宽显著大于CK 处理，增幅分别为27.12%、34.56%、23.90%、26.58% 和32.94%；EM-1 处理地上部干质量、苗高、茎直径、最大叶长和最大叶宽显著大于CK 处理，增幅分别为14.77%、20.84%、27.09%、20.17% 和20.78%；MTD4-1 处理地上部干质量、苗高和最大叶宽显著大于EM-1处理，增幅分别为10.76%、11.35%和10.07%。成苗期到伸根期，MTD4-1 处理地上部干质量、苗高、茎直径、最大叶长和最大叶宽增幅显著大于CK 处理，EM-1 处理和CK 处理各指标增幅之间无明显差异，MTD4-1 处理地上部干质量、苗高、茎直径和最大叶宽增幅显著大于EM-1处理。综上，从成苗期到伸根期，基质中施用菌剂的处理和CK处理烟苗地上部均有生长，EM-1 处理更有助于成苗期烟苗发育，MTD4-1 处理更有助于伸根期烟株发育。

表2 不同微生物菌剂对烟苗地上部生长发育的影响Table 2 Effects of different microbial agents on shoot development of tobacco seedlings

2.4 微生物菌剂对烟苗生理指标的影响

由图3 可知，成苗期EM-1 和MTD4-1 处理根系活力显著高于CK 处理，增幅为27.04%和47.80%；伸根期各处理根系活力差异未达显著性。

图3 不同微生物菌剂对烟株成苗期及伸根期根系活力的影响Fig. 3 Effects of different microbial agents on root activity of tobacco plants at seedling stage and root extending stage

从表3 可以看出，成苗期，与CK 相比，EM-1 和MTD4-1 处理叶绿素a 含量均显著增加，增幅为45.57% 和31.97%；与CK 处理相比，EM-1 处理总叶绿素含量显著增加，增幅为30.14%；各处理叶绿素b、类胡萝卜素差异不显著。伸根期，EM-1 处理叶绿素a、总叶绿素、类胡萝卜素含量显著大于CK 和MTD4-1 处理，与CK 相比，增幅为55.04%、46.61%和115.15%，与MTD4-1相比，增幅为60.00%、52.11% 和82.05%；CK 和MTD4-1 处理色素含量差异不显著。

2.5 根际育苗基质和烟苗根系微生物多样性及其主要表型和生理指标间的相关性

由图4 可知，根际育苗基质微生物多样性和烟苗根系微生物多样性、烟苗总根长、根系平均直径、叶绿素a 和总叶绿素间呈显著正相关（P＜0.05）；烟苗根系微生物多样性和根总表面积、根总体积呈极显著正相关（P＜0.01）。烟苗总根长、根总表面积和叶绿素含量间呈极显著正相关（P＜0.01）。烟苗根总表面积与烟苗叶绿素a 含量呈极显著正相关（P＜0.01），与叶绿素b 及总叶绿素呈显著正相关（P＜0.05）。烟苗叶绿素各指标之间呈极显著正相关（P＜0.01）。

3 讨论

育苗基质或土壤中添加微生物菌剂可以显著增加烟苗或烟株根系干质量、总根长、根总表面积、根平均直径和根总体积［11,27-28］；扈雪琴等［29］研究表明，多粘类芽孢杆菌在苗期对烟草农艺性状促进作用较强，枯草芽孢杆菌在团棵期促进作用较强。类似地，本研究EM-1 和MTD4-1 菌剂的添加均可促进烟苗发育。潘明锦等［30］和李迪秦等［31］研究发现，对烟苗喷施一定浓度的微生物菌剂可以提高根系活力，本研究结果也表明，在育苗基质中添加EM-1 和MTD4-1 菌剂均可显著提升成苗期烟苗根系活力。微生物菌剂可提升叶片叶绿素含量［30-32］，本研究中，EM-1 和MTD4-1 菌剂均可促进烟苗叶片色素合成。

本研究结果表明，在根际育苗基质中添加EM-1 和MTD4-1 菌剂可以显著增加根际育苗基质和烟苗根系的微生物多样性及丰度；烟苗根系微生物多样性和根际育苗基质微生物多样性与烟苗根系发育和烟苗叶片叶绿素含量显著正相关。微生物菌剂可以提升土壤中微生物数量，改变菌落结构［33-36］。微生物菌剂可以促进植物产生一些利于其发育的激素，这些激素可以刺激形成层细胞活动，诱发新根生成。芽孢杆菌类细菌可以产生1-羧基-1-氨基环丙烷，减少植物体内乙烯的合成，保证植物正常生长发育［37-39］。根际微生物还可以通过生物固氮、增溶无机磷酸盐和产生铁载体等方式提高植物根际养分的可利用性，从而促进植物生长［39-40］。由此推断，本研究中，微生物菌剂的添加可以通过增加基质微生物多样性，进而增加烟苗根系微生物多样性，微生物通过刺激烟苗根系产生促进其发育的激素并促进烟苗根系对基质养分的吸收，增加根系活力、促进根系发育从而达到壮苗的目的。

从菌剂作用的时间上来看，基质中EM-1 菌剂的添加更有利于育苗期间促进烟苗发育，基质中MTD4-1 菌剂的添加更有利于伸根期烟苗发育，这两种菌剂在育苗及伸根期对烟苗发育的促进既互补又有时间上的连续。因此，这两种微生物菌剂以不同比例配施是否具有增效作用仍需进一步研究。

4 结论

在育苗基质中添加EM-1 菌剂和MTD4-1菌剂均可以增加烟苗根系及根际育苗基质的微生物多样性，与对照相比，以上两种菌剂对成苗期烟苗根系微生物多样性增幅分别为34.70%和9.59%。在育苗期间添加EM-1 菌剂可以显著促进成苗期烟苗发育，并促进烟苗根系活力提升及叶绿素a 和总叶绿素合成，与对照相比，基质中添加EM-1 菌剂的烟苗根系各指标增幅为10.10%～75.83%，地上部各指标增幅为31.10%～46.63%。在育苗基质中添加MTD4-1菌剂可以促进伸根期烟苗发育，与对照相比，基质中添加MTD4-1 菌剂的烟苗根系各指标增幅为45.35%～118.94%，地上部各指标增幅为26.58%～34.56%。因此，育苗期添加EM-1 菌剂，移栽时配施MTD4-1 菌剂既可以提升烟苗成苗质量，又可以有效促进移栽后烟苗缓苗。