基于AMPK/mTOR通路介导的自噬探讨温补固肾方对糖尿病肾纤维化的影响

禹静，刘续春，李振华

（1.黄淮学院直属附属驻马店市中心医院，河南 驻马店 463000；2.郑州市中心医院，河南 郑州 450001）

糖尿病肾病是慢性肾脏疾病以及终末期肾衰竭的主要病因，也是糖尿病重要的微血管并发症和主要的死亡病因［1］。既往研究发现，全球大约有30%～40%的糖尿病患者会伴随疾病的迁延和进展成为糖尿病肾病，伴有终末期肾病的患者五年生存率低于20%［2］。因此，延缓或阻止糖尿病肾病进展对于改善患者生存质量具有重要的临床意义。糖尿病肾病发病机制复杂，主要包括纤维化、炎症反应、氧化应激以及糖脂代谢紊乱等。众多研究已证实，肾纤维化是糖尿病肾病进行性加重的重要因素［3］。因此，积极寻找能够抑制肾纤维化的新型治疗药物或方式对于改善糖尿病肾病进展具有重大的意义。

中医药在治疗糖尿病肾病方面疗效确切。温补固肾方以温阳补肾固肾为治疗根本大法，佐以收涩补气之品［4］，本课题组前期研究显示，其能够通过下调collagen Ⅲ、TGF-β1 蛋白表达抑制肾纤维化，从而改善糖尿病肾损伤［5］。但是有关温补固肾方对糖尿病肾纤维的调控机制尚不明晰。自噬是细胞中代谢产物及错误折叠蛋白降解的重要途径，即细胞能够通过降解自噬小体内包裹的损伤细胞器、病原体以及蛋白质，从而维持细胞正常的生理功能［6］。研究显示，在糖尿病肾病大鼠中自噬水平被显著性抑制，而激活细胞自噬能够显著抑制糖尿病肾病肾纤维化，改善糖肾损伤［3］。可见，细胞自噬与糖尿病肾纤维化的关系密切，通过调控细胞自噬可能是抑制肾纤维化，改善糖尿病肾病的重要机制。AMPK/mTOR 途径是调节自噬的重要途径之一，AMPK 激活后能够激活TSC1/2 蛋白，进而抑制mTOR 活化，从而诱导细胞自噬形成［7］。因此，本研究拟通过构建糖尿病肾病大鼠模型，探究温补固肾方能否通过调控AMPK/mTOR 通路介导的细胞自噬，抑制糖尿病肾纤维化，并最终改善糖肾损伤。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2021-0002，100只，体质量180～210 g。大鼠适应性喂养7 d，期间正常饮食、饮水，昼夜12 h/12 h 交替光照，温度（25±2）℃，相对湿度45%～55%，动物实验经我院医学伦理委员会批准（批准号：20191002），符合3R原则。

1.1.2 药物与试剂

温补固肾方制剂由广东一方制药有限公司提供，组方：党参0.1 g，山茱萸0.12 g，芡实0.2 g，枸杞子0.1 g，覆盆子0.1 g，菟丝子 0.1 g，淫羊藿 0.1 g，益智仁 0.1 g；达格列净片（AstraZeneca Pharmaceuticals LP，规格：10 mg/片，国药准字J20170040）；AMPK 抑制剂Compound C（美国Selleck公司，货号：S7306）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒、PAS 染色试剂盒、Masson 染色试剂盒、蛋白质浓度测定试剂盒、发光液、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（上海碧云天生物技术公司，货号：C0105S、T4106、T4104、P0011、P0018 FS、A0409、A0413）；免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：SP-9001）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、4%多聚甲醛、2.5%戊二醛固定液（北京索莱宝科技有限公司，货号：S8050、20151211、P1126）；α-SMA 抗体、E-Cadherin 抗体、LC3 抗体、AMPK 抗体、p-AMPK 抗体、mTOR 抗体、p-mTOR 抗体（英国Abcam 公司，货号：ab5694、ab76055、ab192890、ab271188、ab131357、ab134903、ab137133）。

1.1.3 仪器

血糖仪（瑞士Roche 公司，型号：卓越精采型）；多功能酶标仪（长春乐镤科技有限公司，型号：LP-5117）；荧光倒置显微镜（日本/奥林巴斯Olympus，型号：CKX53）；高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司，型号：H3-18KR）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad伯乐公司，型号：Gel Doc XR+）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病肾病模型构建、分组及干预

SD 大鼠腹腔一次性注射STZ（60 mg/kg）构建糖尿病肾病模型。判定标准：STZ 注射后3 d，血糖值均 ≥16.7 mmol/L，且尿液蛋白呈现阳性者，被确认为模型构建成功。雄性SPF 级SD 大鼠100 只，除对照组20 只外，均采用腹腔注射链脲佐菌素（60 mg/kg）构建糖尿病肾病模型。其中60 只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、达格列净组（1.0 mg/kg）、温补固肾方低、中、高剂量组（0.92、1.84、3.68 g/kg），每组各10 只。除对照组外，其余各组大鼠均采用STZ 诱导糖尿病肾病模型。温补固肾方低剂量组剂量为0.92 g/kg，中、高剂量组分别为低剂量组的2 倍和4 倍。达格列净组给予1.0 mg/kg 剂量达格列净灌胃。对照组及糖尿病肾病组大鼠给予等量生理盐水灌胃。以上各组大鼠1次/d，连续灌胃12 周。剩余40 只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、温补固肾方高剂量组（3.68 g/kg）、温补固肾方高剂量组 + AMPK 抑制剂组（20 mg/kg），每组各10 只。除对照组外，其余各组大鼠均采用STZ 诱导糖尿病肾病模型。温补固肾方高剂量组大鼠给予3.68 g/kg剂量灌胃。温补固肾方高剂量组 + AMPK 抑制剂组大鼠给予3.68 g/kg 温补固肾方灌胃，同时予以腹腔注射AMPK 抑制剂Compound C 20 mg/kg［8］。对照组及糖尿病肾病组大鼠予以腹腔注射等量生理盐水。以上各组大鼠均为1次/d，干预12周。

1.2.2 肾功能生化指标检测

各组大鼠分别干预12 周后，每组随机取6 只大鼠进行尾静脉采血，测定血糖值。收集尿液，按照试剂盒检测说明书测定尿蛋白、肌酐及尿素氮含量。

1.2.3 肾组织病理学观察

将肾组织放于10%的多聚甲醛中固定24 h、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、组织石蜡包埋、切片3～5 µm，行HE、PAS 及Masson 染色，显微镜下观察心肌组织形态学变化及心肌纤维化程度。

1.2.4 免疫组化检测α-SMA和E-Cadherin表达

每组随机取6 只大鼠进行肾组织切片，经内源性过氧化物酶阻断剂阻断、抗原修复、组织封闭后，滴加α-SMA 抗体及E-Cadherin 抗体（1∶500），孵育过夜，对应二抗孵育2 h，滴加DAB 显色液，苏木素复染，于400倍显微镜下观察肾组织α-SMA 及E-Cadherin 着色情况，并通过ImageJ 软件计算肾组织α-SMA 及E-Cadherin 阳性细胞数量，以胞浆或胞膜呈棕色颗粒为阳性表达。

免疫组化阳性细胞表达率（%）=免疫组化阳性细胞数量/细胞总数×100%

1.2.5 电镜观察自噬小体及肾组织病理变化

将肾组织修剪成大小为1 mm×1 mm×1 mm组织块，在1%四氧化锇中固定3 h。采用分级乙醇和丙酮梯度脱水后，将样品嵌入Spurr 树脂中，并切成70 nm厚的薄片，最后采用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并用10 000 倍透射电子显微镜观察自噬小体形态与数量。2.5%戊二醛固定肾组织，制备切片，电镜下观察肾组织病理形态变化。

1.2.6 Western blot 检测肾组织LC3-Ⅱ、p-AMPK、p-mTOR表达

给药12周后，立即将大鼠处死，剪取大鼠肾组织并提取总蛋白，按照1∶5质量与体积比加入细胞裂解液，于4 ℃条件下裂解40 min；BCA法测定各组大鼠肾组织蛋白质浓度；蛋白上样（按照每孔上样量30 µg计算得出上样体积）；凝胶电泳；湿转法转膜；5% BSA室温封闭2 h；分别加p-AMPK抗体（1∶1 000）、AMPK抗体（1∶1 000）、p-mTOR抗体（1∶500）、mTOR抗体（1∶1 000）、LC3抗体（1∶1 000）及β-actin抗体（1∶2000），4 ℃孵育过夜；加对应的山羊抗兔二抗或者山羊抗鼠二抗（1∶5 000），室温孵育1～2 h；TBST洗涤3次，每次5 min，滴加显影液，显影并拍照。通过Image J 软件定量分析各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0 统计软件进行数据分析。所有实验结果以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用多因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能情况比较

与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠FBG、BUN、Scr和24 h-UA均显著增加（P＜0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠FBG、BUN、Scr 和24 h-UA 均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠肾功能生化指标比较（±s）

表1 各组大鼠肾功能生化指标比较（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与糖尿病肾病组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别对照组糖尿病肾病组达格列净组温补固肾方低剂量组温补固肾方中剂量组温补固肾方高剂量组24 h-UA/mg 5.49±1.35 44.13±7.39**11.12±2.31##35.74±4.77#30.43±4.45##28.65±5.74##n6 6 6 6 6 6剂量/（g/kg）——0.001 0.92 1.84 3.68 FBG/（mmol/L）5.28±0.25 28.20±4.05**10.59±2.42##23.66±1.99#18.05±2.29##16.23±2.41##BUN/（µmol/L）6.47±1.16 26.75±4.33**8.95±1.54##17.94±4.30##16.53±1.96##12.63±2.42##Scr/（µmol/L）45.07±7.05 101.16±15.82**49.98±7.59##76.69±12.15#69.45±11.19##52.23±11.05##

2.2 各组大鼠组织病理学情况比较

与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠肾小球体积增大，间质增宽，且肾小管上皮细胞出现空泡变性，可见有部分紫红色糖原沉积，呈典型的糖尿病肾损伤。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠肾小球体积增大，间质增宽以及肾小管上皮细胞空泡变性程度均有不同程度的减轻，且紫红色糖原沉积明显降低。见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学图（×400）

2.3 各组大鼠肾纤维化情况比较

与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠α-SMA 表达显著升高，E-Cadherin 表达显著降低（P＜0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠α-SMA 表达显著降低，E-Cadherin 表达显著升高（P＜0.01）。见图2。

图2 各组大鼠肾组织α-SMA和E-Cadherin表达

2.4 各组大鼠肾组织细胞自噬水平情况比较

透射电镜观察各组大鼠肾组织自噬小体数量。结果显示，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠自噬小体数量显著减少。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠自噬小体数量均显著增加。Western blot检测各组大鼠肾组织自噬标志性蛋白LC3表达。结果显示，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠肾组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低（P＜0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组和达格列净组大鼠肾组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。见图3。

2.5 各组大鼠AMPK/mTOR通路蛋白表达情况比较

与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。与糖尿病肾病组组比较，温补固肾方各治疗组和达格列净组大鼠p-AMPK/AMPK 比值升高，pmTOR/mTOR比值降低（P＜0.05或P＜0.01）。见图4。

图4 各组大鼠肾组织AMPK/mTOR通路蛋白表达

2.6 AMPK 抑制对温补固肾方改善糖尿病肾病大鼠肾纤维化的影响

与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠肾组织出现明显的病理损伤，肾小球基底膜弥散性不均增厚，且伴有明显的系膜基质增生，胶原沉积增多。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方高剂量组大鼠肾组织病理性损伤减轻，肾小球基底膜增厚程度明显减轻，胶原沉积减少。与温补固肾方高剂量组比较，温补固肾方高剂量组 +AMPK抑制剂组大鼠肾组织病理损伤加重，肾小球基底膜增厚程度明显加重，胶原沉积增多。与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低，p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方高剂量组大鼠自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高，p-AMPK/AMPK 比值升高，p-mTOR/mTOR 比值降低（P＜0.01）。与温补固肾方高剂量组比较，温补固肾方高剂量组 + AMPK 抑制剂组大鼠自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低，p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高（P＜0.01）。见图5和图6。

图5 AMPK抑制剂对糖尿病肾病大鼠肾组织病理形态及纤维化的影响

图6 AMPK抑制剂对AMPK/mTOR通路介导的细胞自噬的影响

3 讨论

糖尿病肾病属于“肾浊”“水肿”“关格”“肾劳”“溺毒”等范畴，以水液潴留、肾虚阴阳失衡为主要特征，阳气虚衰为糖尿病肾病的主要征象，尤其以肾阳虚为主，另伴有瘀血内阻之象。因此，中医临床治疗糖尿病肾病多以补肾、温阳、固肾为主。温补固肾方具有补气健脾、温阳、补肾之功［4］。本课题组前期研究发现，温补固肾方能够改善糖尿病肾病肾损伤，抑制肾纤维化［5］。本实验研究发现，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠肾功能出现明显病理损伤，α-SMA 表达增加，ECadherin 表达降低，肾组织纤维化程度明显加重。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组大鼠FBG、BUN、Scr、24 h-UA 水平显著降低，肾损伤明显降低，α-SMA表达降低，E-Cadherin表达增加，表明温补固肾方具有抗糖尿病肾纤维化作用。但是，目前有关温补固肾方抗纤维化的作用机制尚不明晰。

自噬是一种高度保守的溶酶体降解途径，是维持细胞内稳态的重要调节机制。既往研究发现，糖尿病肾病中持续性的高糖能够抑制自噬相关蛋白（LC3、Beclin-1）表达，降低自噬水平，阻碍细胞器中积累产生的受损蛋白以及细胞毒性产物的清除，从而导致糖尿病肾病肾损伤以及肾实质细胞功能障碍［9-10］。激活细胞自噬可以显著抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤，改善细胞功能［11］。以上研究表明，自噬水平的不足可能是导致糖尿病肾病进展的重要机制。GUO 等［12］研究发现，在STZ 诱导的糖尿病肾病大鼠肾小管间质纤维化中，伴有明显的自噬抑制，提示自噬可能是糖尿病肾纤维化的重要调节机制。另外，CAO 等［13］研究证实，激活细胞自噬能够抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞间质转化以及糖尿病肾病大鼠肾小管间质纤维化。本研究结果显示，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠自噬小体数量明显减少，且自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ表达显著降低。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组大鼠自噬小体数量均显著增加，且自噬标志性蛋白LC3-Ⅱ表达显著升高，表明温补固肾方可以通过诱导细胞自噬，抑制糖尿病大鼠肾纤维化。细胞自噬受到多种诱因和基因调控的影响，如mTOR、AMPK 以及沉默信息调节剂T1等，以上信号通路与糖尿病肾病的发生、发展密切相关。高糖环境下上述信号通路的激活/抑制是诱导/抑制自噬活性的关键，能够加重/缓解糖尿病肾损伤加重［14-16］。AMPK 和mTOR 是自噬启动环节重要的调节因子，其构成的AMPK/mTOR 信号通路是调控细胞自噬形成的重要通路之一［17］。研究发现，mTOR 可以形成两种不同的复合物，即mTORC1 和mTORC2。在糖尿病肾病大鼠中能够观察到mTORC1信号通路被显著激活。在营养丰富的条件下，mTORC1能够通过磷酸化ULK1和ATG13，从而抑制细胞自噬，被认为是自噬的负调节剂［18］。与mTOR 通路相反，AMPK 是自噬的正调节剂。研究发现，在糖尿病肾病动物模型中AMPK 磷酸化水平被显著抑制。另外，AMPK 能够抑制mTOR 通路的活化，降低mTORC1对ULK1 磷酸化的抑制作用，提高ULK1 活性，从而促进自噬启动环节［19］。本研究结果显示，与对照组比较，糖尿病肾病组大鼠p-AMPK/AMPK 比值显著降低，p-mTOR/mTOR 比值显著升高。与糖尿病肾病组比较，温补固肾方各剂量组大鼠p-AMPK/AMPK 比值显著升高，p-mTOR/mTOR 比值显著降低。以上研究结果初步表明，温补固肾方能够通过调控AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬抑制糖尿病大鼠肾纤维化。张哲等［20］研究发现，利拉鲁肽能够通过激活AMPK/mTOR 信号通路，增加自噬水平，从而减轻糖尿病心肌病大鼠心肌炎症和氧化应激损伤，而给予AMPK 抑制剂Compound C 可以逆转利拉鲁肽对AMPK/mTOR 通路的作用，抑制自噬，加重糖尿病心肌病心肌炎症和氧化应激损伤。为进一步明确AMPK/mTOR 信号通路介导的细胞自噬在温补固肾方治疗糖尿病肾纤维化中的作用。本实验通过对温补固肾方干预组大鼠给予AMPK 抑制剂Compound C。结果显示，AMPK 抑制剂能够逆转温补固肾方对糖尿病肾纤维化的作用，主要表现为p-AMPK/AMPK 比值降低，p-mTOR/mTOR 比值升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，胶原沉积及肾损伤加重。

4 结论

温补固肾方能够激活AMPK/mTOR 通路介导的自噬改善糖尿病大鼠肾纤维化。本研究结果初步阐明了温补固肾方治疗糖尿病肾纤维化的作用及调控机制，为其治疗糖尿病肾纤维化提供了可靠的实验依据。