不同波长光照对周氏啮小蜂黑视蛋白基因表达的影响

刘新宇，王 静，潘丽娜，李 敏

（1.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室∕天津市动物多样性保护与利用重点实验室，天津 300387；2.漯河市豫中南林业有害生物天敌繁育研究中心，河南 漯河 462300）

多数种类的昆虫存在趋光行为，这对寻找食物、交配和搜寻产卵场所等行为起到重要作用［1］。了解昆虫对光的趋向性有助于对昆虫的研究和管理，对趋光性加以利用，可应用于如标本采集、检查检疫、害虫治理、昆虫的监测和预报等工作。基于日益严峻的生态环境及人类健康问题，利用昆虫趋光性进行害虫防治具有重要的优势，因此国内外学者对昆虫趋光性机理领域的研究日益增多与深入。

不同昆虫对特定范围光谱的趋性反应有正负之分，其对特定波长的光具有敏感性，是因为复眼小眼或单眼内有对特定频率光波响应的视觉细胞，这些细胞的细胞膜上存在感光的视蛋白［2，3］。其中，黑视蛋白是一种研究较广泛的视蛋白［4-7］，Provencio等［8］从爪蟾（Xenopus laevis）皮肤黑素细胞和眼中提取分离出具有视蛋白基本结构的物质。在其敏感光波方面，Panda 等［9］测定黑视蛋白对479 nm 波长的光波有最大响应。此外，有文献记载，人类黑视蛋白最大波长为483 nm、猕猴的为482 nm、小鼠的为481 nm、大鼠的为84 nm［10］。还有研究表明，黑视蛋白的感光功能独立于视觉系统［11］。黑视蛋白有着调节生物昼夜节律、成像反应的功能［8］，关于黒视蛋白的研究主要集中在脊椎动物中［12-15］，在无脊椎动物中较少涉及。经NCBI 上检索，在昆虫中仅有瓜实蝇（Bactrocera cucurbitae）、切叶蚁（Acromyrmexechinatior）、豆荚草盲蝽（Lygus hesperus）、掠猛蚁属（Harpegnathos）、柑橘木虱（Diaphorina citri）和中华蜜蜂（Apis cerana）等物种的相关序列信息。

美国白蛾（Hyphantria cunea），又名美国灯蛾、秋幕毛虫，属鳞翅目灯蛾科白蛾属，是中国重要的入侵农业害虫，可危害200 多种林木、果树、农作物和野生植物，最嗜食桑、白蜡槭，其次为梧桐、李、樱桃等［16］，已被列入中国首批外来入侵物种。由于化学防治对环境造成的危害严重，并且美国白蛾的寄主分布广泛，美国白蛾的生物防治逐步引起人们的重视，常用周氏啮小蜂来控制美国白蛾的数量。

周氏啮小蜂（Chouioia cuneaYang）是美国白蛾蛹期的重要寄生性天敌，体长1.1～1.5 mm，群集内寄生于美国白蛾蛹中，是美国白蛾的主要天敌，对抑制美国白蛾的危害起到重要作用［17］。试验观察中证实周氏啮小蜂对光具有很强的趋性，但其趋光性分子机制未见相关研究报道。

本研究对周氏啮小蜂的黑视蛋白基因进行了克隆及分析，并研究了经不同波长光照处理后，利用qPCR 技术检测其表达差异，继而探究周氏啮小蜂趋光性的分子机制。

1 材料与方法

1.1 供试虫源及处理

周氏啮小蜂为实验室培养，培养条件：于PQX-350H 型人工气候箱中，温度25 ℃，相对湿度60%～80%，光周期L∶D = 14 h∶10 h。接种于柞蚕蛹中，待成虫羽化后，从蛹中飞出，收集羽化24 h 内的周氏啮小蜂进行试验。

1.2 试验方法

选取试验光源为红色光（波长在625～740 nm）、黄色光（565～590 nm）、蓝色光（440～490 nm）和白色光4 种颜色的LED 灯，4 个经过DEPC 水处理与高温蒸气灭菌处理的透明离心管。南孚电池、导线、电池盒（用于为不同波长光源供电），TES1330A 型照度计（台湾泰仕电子工业股份有限公司），纱布，脱脂棉，并利用瓦楞纸自制暗室。

以并联方式连接好LED 灯，用照度计测量LED灯垂直照射6 cm 处的光照度，通过添加LED 灯或在灯上用棉花和纱布使其光照度稳定在50～60 lx。将测完光照度的LED 灯按照颜色分别从暗室顶部插入，插入时可从暗室顶部开出小孔。取羽化24 h 内的周氏啮小蜂于离心管中，在4 种光波下照射2 h，之后立即浸于RNAlater（Ambion 公司，AM7020）中备用。

1.3 引物设计

根据之前周氏啮小蜂转录组测序结果得到的黑视蛋白Melanopsin基因，由Primer5 和DNAman 软件设计目的基因Melanopsin实时定量扩增引物。目的片段大小为100～200 bp，其中内参基因为glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GADPH），引物序列见表1，由北京奥维森基因科技有限公司合成。

表1 实时荧光定量PCR 中使用的引物序列

1.4 总RNA 提取

总RNA 的提取参照RNeasyMini Kit 说明书步骤，用RNase 处理总RNA，去除总RNA 中残存的基因组DNA（均为TRAN公司产品）。超微量紫外分光光度计（NanoDrop 2000）在波长260、280 nm 处测定其浓度和纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。

1.5 cDNA 合成

取不同处理总RNA 各5 μL 分别与1 μL 的Random Primer（N9）（0.1 μg∕μL）、10 μL 的2×TS Reaction Mix、1 μL 的TransScript®RT∕RI Enzyme Mix，然后用Rnase-free Water 补足20 μL，将混合体系于恒温水浴锅中先于25 ℃孵育10 min，再于42 ℃中孵育30 min，最后在85 ℃加热5 min 失活TransScript®RT，将cDNA 样品于-20 ℃保存。

1.6 实时定量PCR相对定量检测Melanopsin表达

Real-time PCR 反应体系总体积为20 μL，其中3 μL cDNA 样品（水为空白对照），引物为100 ng∕μL。实时定量PCR 的反应程序为50 ℃预变性2 min，95 ℃变性2 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，共40 个循环。

检测每个样品目的基因和内参基因的Ct值，每个样品设置3 次重复，根据样品的Ct值就可计算出样品所含的模板量，比较目的基因Mel和内参基因GADPH的初始模板量，即可得出目的基因的表达量。

1.7 数据分析

采用独立样本t检验分析4 种颜色的光处理对黑视蛋白基因表达的影响，采用ANOVA 方差分析交配对Mel表达的影响。数据使用统计分析软件SPSS 16.0 进行处理分析。

2 结果与分析

经过实时定量PCR 试验，结果如图1 所示。不同波长的光对周氏啮小蜂黑视蛋白基因的表达量具有一定影响。白色光对黑视蛋白基因的表达无明显的促进作用。在单色光中，黄色光激发的表达量最大（9.99），显著大于其他光处理（P＜0.05），其次为蓝色光（6.66），其表达量显著高于红色光和白色光；最小的是红色光（1.18），其表达量低于白色光（2.41），但二者之间差异不显著。由此可知，周氏啮小蜂的黑视蛋白基因对黄色光波最敏感。此外，根据白色光和黄色光激发的表达量，在黄色光波段，光强对黑视蛋白基因的激发量有显著影响。

图1 4 种波长的光照射周氏啮小蜂2 h 后黑视蛋白基因表达量

3 小结与讨论

已知黑视蛋白在脊椎动物中对波长在481 nm（属于蓝色光范围）附近的光波最为敏感［10］。本试验表明，在周氏啮小蜂中，最能促进黑视蛋白基因表达的是黄色光波（565～590 nm）。此外，相对于特定波长范围内的光波，复合的白色光波对黑视蛋白并无明显的促进作用。白色光是具有连续光谱的复合光，在光子层面表现为能量分布符合E=hv（E为能量，h为普朗克常量，v为光的频率），该公式表明在一定光强度下，单位时间内LED 灯发射有限的特定能量的光子，当光照度在恒定的范围内，光子的总能量保持不变，当光子的频率范围拓宽时（白光），高频率的光子数量减少，导致频率处于黄色光范围内的光子数量减少，进而使得黑视蛋白表达量下降。

结果表明，周氏啮小蜂的黑视蛋白基因对黄色光波敏感，可能与基因中存在对565～590 nm 波长光敏感的光诱导型启动子有关。此外，根据白色光和黄色光激发的表达量，在黄色光波段，光强对黑视蛋白基因的激发量有显著影响。

光诱导型启动子属于天然诱导型启动子，这些启动子位于环境应答基因的上游。在植物中，光诱导型启动子较常见，其常有若干个光应答原件，如G-box、Z-Box、AT-rich 序列等，这些元件对光调控的转录激活是必须的［18］。本研究结果将有助于了解周氏啮小蜂的趋光性机理，为更加科学合理地利用周氏啮小蜂积累相关数据。但关于周氏啮小蜂体内的黄色光敏感的黑视蛋白基因的光诱导型启动子的性质还有待进一步研究。