解磷生物肥对温室土壤磷有效性及辣椒产量的影响

吴红艳， 于淼， 冯健， 刘晖

（辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000）

随着我国设施农业的迅速发展，设施蔬菜种植面积逐年扩大，种植面积超过120 hm2，占我国蔬菜种植面积的18%[1]。由于设施蔬菜种植时地表长期覆盖栽培，土壤处于高温高湿、无雨水淋溶状态，造成了土壤板结、酸化、次生盐渍化、养分失调、土传病害加重等一系列问题，影响蔬菜产量和品质，在一定程度上阻碍了设施农业的可持续发展。磷是植物生长所需的重要元素，是植物体内核蛋白质、磷脂、核酸的重要组成部分，直接参与脂肪和蛋白质代谢，能促进植物幼苗生长及根系发育，缩短成熟期，提高结实率和品质。此外，磷还能提高作物抗旱、抗寒、抗倒伏和抗病虫害能力，促进增产增收。我国土壤虽全磷含量较高，但以可溶性磷盐形式存在被植物直接吸收利用的磷源仅为2%左右，大部分以难溶的无效态在土壤中积累，这不仅耗竭有限的磷资源、造成环境污染，还会给食物安全和人类健康带来影响[2]。因此，施用含磷肥料成为增加土壤肥力的重要手段。目前，我国农用磷肥主要由磷矿加工制成化学磷肥，施入土壤后易与土壤中的钙、镁、铁、铝离子结合，形成难溶的螯合磷酸盐，大大降低磷的利用率，长期施用会造成土壤板结和环境污染[3-4]。提高土壤中有效磷含量、减少磷肥对环境的污染，是目前亟待解决的难题。

在众多土壤磷有效性影响因素中，微生物对土壤磷转化和利用起着重要作用。王应兰[5]研究发现，细菌肥料以及菌液的施用都会影响土壤吸收利用磷的能力。解磷菌是土壤中能将难溶性磷转化为植物可吸收利用可溶性磷的微生物类群，主要通过分泌各种酶类、有机酸来活化土壤中的难溶性磷，提高土壤有效磷含量，促进作物的生长发育[6]。作物根际区域是个复杂的生态环境，需要微生物与作物根系共同作用才能完成物质吸收和运输过程。因此，利用解磷菌的转化作用制成肥料、有效提高土壤有效磷含量并促进作物吸收利用，是解决上述难题的一种有效途径。胡英宏等[7]研究表明，微生物菌肥具有增加土壤肥力、增强植物对养分吸收、提高作物抗病能力、减少环境污染等多种功能。另有研究表明，微生物菌剂中含有的功能菌能优化土壤微生物种群结构，增强土壤酶活性，加快土壤有机物质分解并促进固定养分的有效转化，进而促进植株根系及地上部的生长[8-9]。生物有机肥是一种新型的生物肥料，不仅含有大量的有机质和丰富的微量元素，还含有活跃的微生物菌群和活性酶[10]，所发挥的肥效主要源于微生物生命活动，从而改良土壤[11]、促进植物生长、提高作物品质、增加作物产量[12]。解磷菌的应用对改善土壤结构、提高土壤中磷利用率、改良盐碱地和维持农林业生态平衡等具有重要意义[13]。现今解磷生物有机肥存在企业发展过快，产品质量参差不齐，产品中成分构成不科学等问题。本研究将从设施辣椒土壤中分离得到的解磷菌P623-9 与有机肥复配，制成新型解磷生物肥（PSWY），以北方温室广泛栽培的辣椒为试验材料，采用室内盆栽试验方法研究分析新型解磷生物肥（PSWY）、解磷菌P623-9 和鸡粪（腐熟）对土壤有效磷（available phosphorous，AP）、微 生 物 量 磷（microbial biomass phosphorus，MBP）含量及辣椒根系、地上部干重和产量的影响，以期为其市场化应用和推广提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株及植物材料 供试菌株为解磷菌，为辽宁省微生物科学研究院自辣椒植株土壤中分离筛选得到的韩国假单胞菌（Pseudomonas koreensis），菌株编号P623-9，具有发明专利权（专利号ZL2019 1 1323360.4），现由广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号GDMCC NO. 60806。

供试植物材料为辣椒，品种为‘辣椒409’。

1.1.2 培养基 解磷菌液体培养基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，Ca3(PO4)22.0 g，1% FeSO4·7H2O 1 mL，1% MnSO4·4H2O 1 mL，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。

解磷菌固体培养基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)22.0 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 解磷生物有机肥载体筛选 腐殖酸（史丹利农业集团股份有限公司，含有机质62%、氮1.6%、磷0.86%、钾0.31%）是一类有机物质，具有吸收、络合、交换等功能及良好生理活性，且环境友好、材料易得。蚯蚓粪（石家庄上禾生物科技有限公司，含有机质49%、氮2.6%、磷2.0%、钾1.0%）是一种具有很好的孔性、通气性、排水性的细碎类物质，具有吸收和保持营养物质能力。鸡粪（腐熟）（辽宁朝阳五谷丰生物科技有限公司，含有机质51%、氮2.34%、磷2.32%、钾0.98%）可增加土壤吸附表面积，提高土壤保水、保肥和透气性能，调节土壤温度，在生态农业建设、无公害农业生产等方面具有不可忽视的作用[14]。试验选择腐殖酸、蚯蚓粪、鸡粪（腐熟）作为菌肥载体，从其生物毒性、吸水性及有效菌体释放量等方面筛选出最适合作为菌肥吸附剂的载体。

①毒性分析。将P623-9 菌液分别接种于3 种含有5 g 灭菌供试载体的50 mL 蒸馏水中，200 r·min-1震荡2 h，过滤备用。利用梯度稀释法测定有效菌数量，与原始接种菌落数进行比较，判断载体对菌种生长是否具有毒性。

②载体吸水性及有效菌体释放率测定。将3 种供试载体分别粉碎、研磨，过60 目筛，置高压蒸汽灭菌锅中121 ℃高压蒸汽灭菌1 h 后，置于鼓风干燥箱中105 ℃烘干至恒重，冷却至室温，分别取10 g供试载体在无菌条件下少量多次将无菌水与其充分混匀，使载体材料湿润、疏松但不结块，记录载体吸水量。

将3 种供试载体灭菌后分别加入与无菌水等量的菌种发酵液，混合均匀后室温晾48 h后，精确称取10 g 供试载体，置于100 mL 无菌水中200 r·min-1充分混匀4 h，立即使用梯度稀释法涂布于平板，根据下列公式计算载体有效菌体释放率。

1.2.2 解磷生物有机肥（PSWY）的制备 将解磷菌P623-9 发酵液分别与3 种载体复配（其中，PSWY 载体为腐熟鸡粪，养分含量为氮2.34%、磷2.32%、钾0.98%；发酵液与载体的比例均以有效活菌数计，即有效活菌数在0.2×108CFU·mL-1以上），湿度≤30%，置干燥阴凉处保存备用。

1.2.3 不同载体中菌体存活数量测定 采用稀释平板法，将保存在室温的解磷生物有机肥（PSWY）分别在第5、10、15、30、45、60 天时测定有效活菌数，同时采用肉眼直接观察法检查保存过程中是否有霉变（如青霉、曲霉污染）、是否有异味产生等。

1.2.4 盆栽试验设计 供试土壤为辽宁省微生物科学研究院试验基地日光温室大棚耕层土壤，褐土，pH 7.2，有效磷含量39.8 mg ·kg-1，微生物量磷22.6 mg·kg-1，总氮1.59 g ·kg-1。选用直径17 cm、高30 cm的塑料花盆，每盆装风干土5 kg，解磷生物有机肥在辣椒定植时与化肥（常规施肥）一同施入。

试验设4 个处理，分别为常规施肥（N 100 kg·hm-2、P2O570 kg·hm-2、 K2O 80 kg·hm-2，CK）、常规施肥+鸡粪（腐熟）3 000 kg·hm-2（PY1）；常规施肥+PSWY 3 000 kg·hm-2（PY2）；常规施肥+解磷菌P623-9 240 L·hm-2（PY3）。辣椒于9月7日定植，12月7 日收获。有机肥施用量根据每年所用肥料养分分析结果，以全磷含量为标准折算。本研究中所有处理均将尿素、磷和钾肥按常规施肥量作为基肥一次性施入，不再追肥，施肥方法为播种前施入定植植株底部2～3 cm 处，各处理均按日光温室大棚辣椒常规管理方式管理。通过评价辣椒盆栽试验中土壤解磷菌数量、土壤有效磷、微生物量磷含量、辣椒地上部干重和产量筛选解磷生物有机肥施用量[15]。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 供试样品采集及处理 土壤样品在植株不同生长时期进行采集，去除表层土壤及根系，采集各处理表层土壤（0—20 cm），混合均匀，3 个重复，一部分鲜样用于分析土壤有效活菌数及微生物量磷含量；另一部分样品阴凉处风干，去杂，过1 mm筛后用于测定土壤有效磷（AP）含量。

1.3.2 土壤解磷菌数量测定 土壤样品混合均匀，称取5 g置于45 mL无菌水中30 ℃振荡30 min，采用平板梯度稀释法将不同水平的土壤溶液涂布于解磷菌固体培养基平板上，30 ℃培养48 h，观察菌落生长情况，并计数。

1.3.3 土壤有效磷和微生物量磷含量测定 土壤有效磷（AP）含量采用HCl-H2SO4浸提，利用全自动流动注射分析仪MAC3（iFIA7，北京吉天仪器有限公司）测定[16]；土壤微生物量磷（MBP）含量采用氯仿熏蒸提取法测定[17]。

1.3.4 辣椒地上部干重及根系测定 在辣椒生长90 d 时收获，贴近地面将地上部分剪下，置于105 ℃杀青30 min 后，80 ℃烘干至恒重，然后称重[16]；同时小心将根取出，洗净泥沙，阴干。测量主根直径、根长，并对根系进行称重。

1.3.5 辣椒产量测定 辣椒产量为连续采收计产，置于105 ℃杀青30 min 后，80 ℃烘干至恒重，进行称重[16]，于结束期合并计算。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2007 进行数据整理与计算，采用SPSS 25.0 进行单因素方差分析，选用LSD（P<0.05）进行多重比较，进行差异显著性及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 载体选择

不同载体毒性分析结果表明，3 种载体中有效菌体存活数量表现为鸡粪（腐熟）>腐殖酸>蚯蚓粪，均高于原始接种菌落数，说明3 种载体对于菌体生长均无毒性，因此均具有作为菌肥载体的潜力。载体吸水能力在一定程度上可以反映不同载体对于菌株的吸附能力；而有效菌体释放率直接影响生物有机肥的使用效果。由表1 可知，蚯蚓粪吸水能力较强，鸡粪（腐熟）次之，最弱的为腐殖酸；蚯蚓粪吸水能力虽强，但其菌体释放率为3 种载体中最低的，仅为59%，鸡粪（腐熟）的有效菌体释放率最高，达85%，腐殖酸次之，为72%。

表1 载体吸水性及有效菌体释放率Table 1 Carrier hydroscopicity and effective cell release rate

由图1可以看出，室温条件下有效活菌数随着时间变化较大，解磷菌P623-9在腐殖酸、蚯蚓粪和鸡粪（腐熟）3 种载体中的存活数量在15 d 内无显著差异，在30 d 时各处理均达到峰值，分别为1.91×109（lg 9.28）、6.53×108（lg 8.81）和5.95×109（lg 9.77） CFU·g-1，各处理差异显著（P<0.05）；60 d时在3 种载体中的存活量分别为原始接菌数量的2.10%、0.38%和44.50%，载体为鸡粪时与腐殖酸和蚯蚓粪均存在显著差异（P<0.05）；3 种载体在60 d 监测时间内均无青霉、曲霉等污染，无异味。以上结果表明，最适合以解磷菌P623-9 制备解磷生物有机肥的载体为鸡粪（腐熟）。

图1 不同载体不同时间下的菌体存活数量Fig. 1 Survival number of bacteria in different carriers at different times

2.2 不同施肥处理对土壤解磷菌数量的影响

由图2 可以看出，整个辣椒生长过程中各处理解磷菌活菌数量均在30 d 时达到峰值，CK、PY1、PY2 和PY3 分别为2.15×104（lg 4.33）、2.39×108（lg 8.38）、1.81×1010（lg 10.26）和8.31×108（lg 8.92） CFU·g-1，之后总体呈下降趋势，生长至60 d时PY1、PY2解磷菌活菌数量与其他2个处理差异显著（P<0.05），收获期降至最低水平，在1.05×103（lg 3.02）～2.17×105（lg 5.34） CFU·g-1，此时PY1 与PY2 相比活菌数差异不显著。可见，在同一化肥施用量条件下，施肥方案PY2 对土壤中解磷菌数量具有较大影响。

图2 不同施肥处理下土壤解磷菌数量Fig. 2 Quantity of soil phosphorus solubilizing bacteria in different fertilization treatments

2.3 不同施肥处理对土壤有效磷含量的影响

由图3 可以看出，在辣椒整个生长过程中各处理土壤有效磷（AP）含量变化趋势基本相同，均在30 d 时达到峰值，90 d 时降至较低水平。生长期内，CK、PY1、PY2 和PY3 有效磷含量平均值分别为32.33、45.56、65.63 和57.31 mg·kg-1，较CK 分别提高40.9%、73.1%和38.1%，PY2 处理明显高于其他3 个处理；辣椒生长至30 和60 d 时，PY2 处理土壤AP 含量与其他3 个处理均存在显著差异（P<0.05），而降至较低值时（90 d）PY2 与其他3 个处理仍呈现显著差异（P<0.05）。因此，辣椒生长过程中PY2 处理土壤AP 含量均较高，说明适量施用解磷生物有机肥（PSWY）能够有效提高土壤AP 含量。

图3 不同施肥处理下土壤有效磷含量Fig. 3 Soil available phosphorus content under different fertilization treatments

2.4 不同施肥处理对土壤微生物量磷的影响

由图4 可知，在辣椒生长期内各施肥处理土壤微生物量磷（MBP）整体变化趋势基本相同，30 d前均呈上升趋势，在30 d时达到峰值，然后开始降低，至60 d 趋于稳定后缓慢下降，直至生长结束。整个生长期CK、PY1、PY2、PY3 的MBP 平均值分别为18.47、22.79、29.35 和26.86 mg·kg-1，PY1、PY2 和PY3 较CK 分别提高23.4%、58.9%和45.4%。在生长30 d时，PY2处理与其他3个处理土壤MBP 含量均差异显著（P<0.05），PY1 和PY3处理差异不显著，但二者与CK 相比均差异显著（P<0.05）；而生长至60 d时，4个处理之间MBP含量均差异显著（P<0.05）。因此，解磷生物有机肥（PSWY）可以有效提高土壤MBP 含量。

图4 不同施肥处理下土壤微生物量磷含量Fig. 4 Soil microbial biomass phosphorus content in different fertilization treatments

2.5 不同施肥处理对辣椒地上部干重及根系的影响

由图5 可知，在辣椒生长期结束时地上部干重表现为PY2>PY1>PY3>CK，PY1、PY2、PY3 处理较CK 分别增加81.9%、122.2%和66%，且PY2处理与其他3 个处理差异显著（P<0.05），表明PY2处理对于提高辣椒地上部干重具有显著促进作用。由表2 可知，PY1、PY2 和PY3 处理的辣椒整根干重较CK 分别增加29.0%、62.0%和4.9%，且PY2 与其他3 个处理差异显著（P<0.05）；根长度PY1、PY2 和PY3 处理 较CK 分别增加3.2%、19.4%和16.0%，PY2 处理与PY1、CK 差异显著（P<0.05），与PY3差异不显著；主根直径PY1、PY2和PY3 处 理 较CK 分 别 增 加12.3%、26.0% 和9.2%，PY2 与其他3 个处理均差异显著（P<0.05）。表明PY2 处理即解磷生物有机肥（PSWY）对于辣椒根系生长发育具有良好促进作用。

图5 不同施肥处理下辣椒地上部干重Fig. 5 Aboveground dry weight of pepper under different fertilization treatments

表2 不同施肥处理下辣椒整根干重、长度及主根直径Table 2 Whole root dry weight， length and taproot diameter of pepper under different fertilization treatments

2.6 不同施肥处理对辣椒产量的影响

图6 结果表明，辣椒产量表现为PY2>PY1>PY3>CK，PY1、PY2 和PY3 处理较CK 分别增产10.9%、14.5% 和7.7%，与CK 相比均差异显著（P<0.05），且PY2 与其他3 个处理均差异显著（P<0.05），表明解磷生物有机肥（PSWY）对辣椒具有显著增产效果。

图6 不同施肥处理下的辣椒产量Fig. 6 Pepper yield under different fertilization treatments

2.7 土壤解磷菌数量、土壤有效磷、微生物量磷和植株地上部干重及产量相关性分析

由表3 可知，在辣椒生长期内土壤有效磷与土壤解磷菌数量、辣椒地上部干重、辣椒产量、壤微生物量磷含量均呈显著正相关（P<0.01）；辣椒产量与植株地上部干重、土壤解磷菌数量和土壤微生物量磷含量均呈显著正相关（P<0.01）。可见，在相同施用化肥条件下适量增施解磷生物有机肥时，随着土壤中解磷菌数量增加微生物量磷及有效磷含量也随之显著增加，辣椒地上部干重和产量也相应显著增加，土壤AP、MBP 含量及其周转对提高辣椒潜在供磷能力具有重要意义。

表3 土壤有效磷含量、辣椒地上部干重、辣椒产量、土壤解磷菌数量及微生物量磷的相关性分析Table 3 Correlation analysis between number of soil phosphorus solubilizing bacteria， soil MBP， plant dry weight， pepper yield and soil AP

3 讨 论

3.1 解磷生物有机肥对土壤微生物量磷和有效磷的促进作用

本研究中，土壤AP和MBP含量均在30 d时达到峰值，这与已有研究结果一致[18]。张博凯等[18]研究发现，施入磷肥能够很快转化为微生物量磷,约30 d 时高达87%的32P 转化为微生物量磷。究其原因,可能与土壤微生物以多聚磷酸盐富集磷的作用有关，微生物活性越高，富集磷的能力越强，土壤呼吸速率与土壤微生物含磷量变化趋势一致，微生物量磷是土壤最活跃的磷组分。微生物量磷对土壤环境变化十分敏感，温度、干湿交替、不同土壤剖面层次、理化性质及管理措施改变均可引起土壤微生物量磷的变化[19]，在PSWY 施入土壤后辣椒生长前期和中期时增加了有效磷的累积量，此时解磷菌能活化根系周围磷元素，使土壤有效磷含量处于上升水平[20]，使其易被植物吸收，而有很大一部分磷素迅速转化为微生物量磷，并在30 d 时随着微生物死亡而缓慢地释放出来,这在一定程度上减少了磷的物理化学固定,从而提高了磷肥利用效率[21]。另外，本研究中土壤AP含量增加了73.1%，而方华舟等[22]研究显示，解磷菌剂处理稻田土壤，仅使土壤有效磷含量增加32.17%，说明单独施用有机肥时虽在一定程度上有利于减少土壤氮素的淋失，但会增加磷素淋失风险[23]，从而造成土壤养分不均衡，影响作物生长发育及产量。

3.2 解磷生物有机肥可增加地上部干重、促进辣椒根系生长发育并提高产量

Guiñazú等[24]从堆肥中分离出2株具有较强解磷能力的菌株,并将其制成菌剂,发现其对苜蓿生长具有良好的促进作用；Hameeda 等[25]通过盆栽及田间试验研究表明,解磷菌剂能较好地促进玉米生长，这与本研究中解磷生物有机肥能促进辣椒地上部干重增加的结果一致。本研究中，施用解磷生物有机肥辣椒整根干质量、根长和主根直径均增加，促进了根系的生长发育，这与蒋欣梅等[26]研究结果一致，原因在于生物有机肥应用于作物根区时，能刺激植物吸收营养、提高营养效率。有研究认为生物有机肥促进养分积累主要是通过促进根系生长，提高根系活力来实现的[27]。本研究中，辣椒产量显著增加，与苑伟伟等[28]和曾洪玉等[29]研究结果相一致。任朝辉等[30]研究认为，适量施用磷肥可以显著提高作物的产量，过量施用则会导致减产，这与本研究结果一致，当单独施用菌液时造成磷素过量，土壤有效磷含量降低，辣椒产量减少。磷对农作物产量有重要的影响，适量的磷肥能够有效促进农作物的正常生长，但磷肥用量过多时会引起植株体内磷素或氮素过度集中，引起磷素积累，从而抑制生物量的累积[31]，进而影响农作物的生长发育。因而适宜的生物累积量及合理的养分累积吸收是促进辣椒生长发育和实现高产的重要因素。

本研究表明，施用解磷生物有机肥（PSWY）后提高了土壤有效磷含量，对辣椒根系及地上部干重均具有良好的促进作用，辣椒产量与对照相比增加14.5%，与其他3 个处理均具有显著差异。因此，PSWY 可提高土壤磷素周转库容，增强土壤磷素转化和供给能力，提高辣椒植株吸磷量，增产增收，为设施农业可持续发展提供了理论依据。