依托咪酯对心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌损伤的影响

陈祖乔,王 芳,尹涛源

缺血性心脏病具有较高的发病率和死亡率,缺血后,由手术或药物引起的溶栓再灌注可能进一步促进心脏损害,这种现象称为心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)损伤[1-2]。MI/R损伤的潜在机制尚未明确,关键因素包括能量代谢紊乱、氧化应激、钙超载、心肌细胞凋亡、自噬及血管内皮细胞功能障碍[3]。在临床上,MI/R损伤对病人的治疗策略有较大影响,可能引发一系列不良并发症,通过干预MI/R损伤后心肌内相关反应可延缓或减轻心肌损伤,是改善MI/R损伤的重要策略。

依托咪酯是一种非巴比妥类静脉镇静药,也是咪唑衍生物静脉麻醉剂,通过与外周α2B受体结合,引起外周血管收缩,并在诱导麻醉期间维持稳定的血流动力学状态[4]。依托咪酯可避免麻醉诱导后低血压发生,降低心肌损伤发生率,改善心脏术后病人预后[5]。相关研究表明,依托咪酯对脑缺血再灌注与MI/R损伤均有一定的保护作用[6-7]。本研究通过构建MI/R大鼠模型,观察依托咪酯对MI/R大鼠心肌功能的作用基础上探讨可能作用的相关机制,并测定其对脂代谢的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级SD大鼠65只,雄性,6～8周龄,体质量260～300 g,由海南药物研究所有限责任公司提供。将大鼠饲养于无菌动物饲养箱内,环境温度22～25 ℃,相对湿度40%～50%,12 h/12 h昼夜交替,期间大鼠自由饮水、摄食。本研究通过我院伦理委员会批准。

1.2 实验试剂与材料

依托咪酯[江苏恩华药业股份有限公司,批号:H20020511;规格:10 mL(20 mg)];酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(R&D Systems公司);总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒(北京中生生物工程公司),脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(上海碧云天生物研究所);末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(北京博奥森生物公司);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司);抗体Beclin-1、p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ(英国Abcam公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和β-actin抗体(美国Santa Cruz公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒和增强型电化学发光(ECL)溶液(南京凯基生物有限公司);其他试剂均为国产分析纯。

1.3 动物模型制备

大鼠消毒后,注射40 mg/kg的戊巴比妥钠麻醉,将其仰卧固定在动物实验台上,气管插管并连接动物呼吸器进行机械通气,并进行心电监护。在大鼠左侧第3肋骨、第4肋骨处约0.5 cm处剪开皮肤,进行开胸剖腹手术,剪开心包,使心脏完全暴露,使用6-0丝线穿过左冠状动脉前降支下约2 mm作一活结结扎,阻塞左冠状动脉前降支,结扎30 min,松开结扎线后再灌注120 min,观察缺血时心电图出现ST段抬高或T波高耸,心肌组织颜色发白,呈发绀状,缺血区在再灌注后心电图S-T段下移50%以上,心肌颜色逐渐恢复为红色,提示MI/R损伤模型制备成功[8],之后立即关闭胸腔,缝合腹部切口,消毒后置于无菌动物饲养箱中饲养。假手术组大鼠仅暴露心脏,不进行结扎,其余操作均相同。术后给予大鼠注射1.5 mL/kg的硫酸庆大霉素,每日1次,持续3 d,避免伤口感染。

1.4 动物分组与处理

50只SD大鼠制备MI/R模型,造模过程中有5只大鼠失败或死亡。将45只大鼠随机分为心肌缺血再灌注组(MI/R组)、依托咪酯低剂量组和依托咪酯高剂量组,每组15只;另取15只SD大鼠制备假手术模型,作为假手术组。术后参照文献[7],依托咪酯低剂量组和依托咪酯高剂量组大鼠分别腹腔注射10、20 mg/kg的依托咪酯,假手术组和MI/R组注射等体积生理盐水,每日1次,持续14 d。

1.5 心功能指标测定

给药结束后,利用小动物BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司,批号:2014012)评估各组大鼠心功能参数变化。注射10%水合氯醛麻醉大鼠,将其固定在手术台上,进行超声心动图检查,测定射血分数(EF)、缩短分数(FS)、左室收缩末期内径(LVESD)及左室舒张末期内径(LVEDD)。

1.6 心肌损伤指标及脂代谢指标测定

给药结束后,经大鼠尾静脉采血2 mL,室温静置2 h后,将采集到的各组大鼠血液置于4 ℃低温离心机中,以4 000 r/min离心20 min,制备血清、血浆。将样品加入各反应孔,使用大鼠特异性ELISA试剂盒检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、乳酸脱氢酶(LDH)含量;按照试剂盒说明书测定TC、TG、HDL-C含量及LPL、HL活性,所有步骤严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 HE染色检测心肌组织病理变化

采血完成后,处死各组大鼠,获取左心室心肌组织,生理盐水冲洗干净,并固定在4%多聚甲醛缓冲液中,固定后乙醇脱水,进行常规石蜡包埋,切片机上切成厚度约为5 μm切片,切片脱蜡水化后,HE染色法观察心肌组织病理学变化。苏木素染色10 min,流水冲洗掉表面多余染液,1%乙醇-盐酸分化数秒,伊红染色1 min,乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,采用SMZ745型光学显微镜(日本尼康公司)观察各组大鼠心肌组织损伤情况并采集图片。

1.8 TUNEL检测心肌细胞凋亡情况

将心肌组织石蜡切片在60 ℃烘箱烘烤2 h,冷却后,置于20 μg/mL蛋白酶K中室温孵育15 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗切片,加入50 μL TUNEL试剂液,37 ℃孵育 1 h,加入过氧化物酶转化剂,37 ℃继续孵育30 min,PBS清洗切片,采用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min,中性树胶封片,光学显微镜下观察并计数TUNEL阳性细胞数,TUNEL阳性细胞呈绿色荧光,阴性细胞不着色,显微镜下随机选择6个视野计数,TUNEL阳性细胞率=(TUNEL阳性细胞数目/总细胞数目)×100%。

1.9 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测自噬相关蛋白表达

在无菌条件下将心肌组织剪碎,加入液氮研磨,采用预冷的RIPA缓冲液进行裂解,提取总蛋白样品,参照说明书的步骤采用BCA法检测蛋白浓度。取等量各组蛋白样品通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质,分离后电转移至PVDF膜上,室温下在5%脱脂奶粉中封闭2 h,之后加入稀释的兔抗Beclin-1(1∶1 000)、p62(1∶1 000)、LC3-Ⅰ(1∶1 000)、LC3-Ⅱ(1∶1 000)作为一抗抗体,4 ℃孵育过夜。次日,TBST洗膜,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(1∶5 000)作为二抗抗体,室温下孵育1 h,TBST再次洗膜,滴加增强的ECL化学发光液显色曝光,凝胶成像系统拍照,通过Image-ProPlus 6.0图像分析软件对各蛋白条带进行分析,以β-actin作为内参对各蛋白条带的灰度进行定量。

1.10 统计学处理

2 结 果

2.1 依托咪酯对MI/R大鼠心功能的影响

与假手术组比较,MI/R组大鼠EF和FS降低,LVESD和LVEDD升高(P<0.05);相较于MI/R组,依托咪酯低剂量组、依托咪酯高剂量组EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05);与依托咪酯低剂量组比较,依托咪酯高剂量组EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低(P<0.05)。详见图1、表1。

表1 各组大鼠心功能指标EF、FS、LVESD及LVEDD比较(±s)

图1 各组大鼠超声心动图图像

2.2 依托咪酯对MI/R大鼠血清心肌损伤标志物水平的影响

与假手术组比较,MI/R组大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH含量均升高(P<0.05);相较于MI/R组,依托咪酯低剂量组、依托咪酯高剂量组血清CK-MB、cTnI、LDH含量均下降(P<0.05);与依托咪酯低剂量组比较,依托咪酯高剂量组CK-MB、cTnI、LDH含量均下降(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH含量比较(±s)

2.3 依托咪酯对MI/R大鼠心肌组织病理变化的影响

HE染色结果显示,假手术组大鼠心肌细胞核排列整齐,结构清晰,心肌纤维紧密,未观察到心肌纤维或胶原组织增生;MI/R组大鼠心肌细胞排列紊乱,心肌纤维变大,胶原组织增生,多数心肌纤维断裂,有大量炎性细胞浸润;与MI/R组比较,依托咪酯低剂量组、依托咪酯高剂量组心肌细胞和心肌纤维损伤程度均减轻,其中依托咪酯高剂量组大鼠心肌组织病理现象改善更显著。详见图2。

图2 各组大鼠心肌组织病理学变化(HE染色)

2.4 依托咪酯对MI/R大鼠心肌细胞凋亡的影响

与假手术组比较,MI/R组大鼠心肌组织染色细胞较多,TUNEL阳性细胞比例升高(P<0.05),说明凋亡细胞增加;与MI/R组比较,依托咪酯低剂量组、依托咪酯高剂量组大鼠心肌组织中染色细胞减少,TUNEL阳性细胞比例均下降(P<0.05);与依托咪酯低剂量组比较,依托咪酯高剂量组染色细胞减少,TUNEL阳性细胞比例下降(P<0.05)。详见图3、图4。

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡图

图4 各组大鼠心肌细胞凋亡阳性率比较的柱状图(MI/R组与假手术组比较,＊P<0.05;与MI/R组比较,#P<0.05;与依托咪酯低剂量组比较,△P<0.05)

2.5 依托咪酯对MI/R大鼠心肌组织自噬的影响

与假手术组比较,MI/R组大鼠心肌组织中Beclin-1蛋白表达上调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,p62蛋白表达下调(P<0.05);与MI/R组比较,依托咪酯低剂量组、依托咪酯高剂量组大鼠心肌组织中Beclin-1蛋白表达下调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,p62蛋白表达上调(P<0.05);与依托咪酯低剂量组比较,依托咪酯高剂量组心肌组织中Beclin-1蛋白表达下调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降(P<0.05)。详见图5。

图5 各组大鼠心肌组织中自噬相关蛋白表达(A为各组自噬相关蛋白条带图;B为各组Beclin-1蛋白表达比较柱状图;C为各组p62蛋白表达比较柱状图;D为各组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值比较柱状图。a为假手术组;b为MI/R组;c为依托咪酯低剂量组;d为依托咪酯高剂量组。与假手术组比较,＊P<0.05;与MI/R组比较,#P<0.05;与依托咪酯低剂量组比较,△P<0.05)

2.6 依托咪酯对MI/R大鼠脂代谢的影响

与假手术组比较,MI/R组大鼠血清TC、TG浓度升高,HDL-C浓度、血浆LPL和HL含量降低(P<0.05);与MI/R组比较,依托咪酯低剂量组和依托咪酯高剂量组大鼠血清TC、TG浓度降低,HDL-C浓度、血浆LPL和HL含量升高(P<0.05);与依托咪酯低剂量组比较,依托咪酯高剂量组大鼠血清TC、TG浓度降低(P<0.05),HDL-C浓度、血浆LPL和HL含量升高(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠TC、TG、HDL-C、LPL、HL含量比较(±s)

3 讨 论

MI/R是一种常见的病理现象,涉及心肌代谢紊乱和结构重塑。阐明MI/R的潜在机制并探索MI/R的有效治疗策略,是临床中攻克的难点之一。本研究通过冠状动脉结扎法构建MI/R大鼠模型,观察依托咪酯在大鼠MI/R损伤中的作用,并初步探究其机制。

大量研究表明,依托咪酯在多种疾病手术中发挥着有益作用。Li等[9]在胫骨骨折手术中使用依托咪酯进行麻醉,可抑制下肢缺血/再灌注损伤所致的氧化应激反应,并降低炎性因子水平。徐召溪等[10]研究显示,依托咪酯可增加大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞存活,其机制可能与降低细胞内Ca2+水平、抑制蛋白激酶C(PKC)/核转录因子(NF)-κB信号通路相关。已有研究表明,依托咪酯对缺血再灌注大鼠的心肌损伤可发挥保护作用[7]。本研究结果显示,经依托咪酯治疗的MI/R大鼠EF、FS升高,LVESD、LVEDD降低,血清心肌损伤标志物CK-MB、cTnI及LDH含量均下降,心肌病理学改变得到改善,进一步明确依托咪酯具有减轻MI/R损伤、改善心功能的作用。

自噬是一种高度保守的机制,在代谢压力下触发降解细胞质大分子物质或细胞器,可为自身提供能量,是细胞内蛋白质质量控制系统的主要组成部分之一,也是细胞中普遍存在的降解机制,可去除受损的细胞器,维持细胞稳态[11]。在各种病理情况下,包括各种缺血再灌注损伤,相关器官组织可迅速诱导自噬发生。在基础状态下,自噬可维持心肌细胞的活性与结构,从而维持心脏发挥正常功能。短暂的缺氧应激可诱导自噬增强,通过回收受损的细胞器和蛋白质促进细胞存活。然而,长时间缺氧和再灌注导致过度自噬,引起心肌细胞死亡[12-13],因此,抑制MI/R引起的过度自噬可能是预防MI/R损伤的有效目标。Luo等[14]研究显示,京尼平苷可减小大鼠心肌梗死面积,改善心功能,其机制可能与抑制自噬与激活蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路有关。Zuo等[15]研究显示,川芎嗪降低了MI/R大鼠和H/R心肌细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值与Beclin-1表达,通过调控磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Bcl-2信号级联反应,缓解自噬功能障碍,从而对MI/R发挥保护作用。Beclin-1是自噬的关键调节剂,在其启动和进程中均发挥着重要作用,通过激活各种细胞信号通路调控自噬发生。存在于细胞质中的p62与经泛素化蛋白结合,与LC3-Ⅱ结合形成复合物,在溶酶体内发生降解。本研究结果与上述结果一致,经过依托咪酯治疗后,MI/R大鼠中Beclin-1表达下调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降,且p62蛋白表达上调,说明依托咪酯抑制了MI/R后诱导的心肌细胞过度自噬,从而发挥心肌保护功能。

越来越多的研究表明,MI/R损伤涉及多项生物过程和信号传导途径,如细胞内钙超载、活性氧积累、心肌细胞凋亡及炎症反应等。MI/R损伤发生后,在缺血缺氧刺激下,细胞核内凋亡相关蛋白基因呈高表达,进一步促进细胞凋亡发生[16]。心肌细胞正常的凋亡程序被扰乱,导致心脏重塑,引起心功能衰竭[17],因此,在改善MI/R损伤中抑制心肌细胞凋亡是一个关键环节。本研究结果显示,通过依托咪酯治疗的MI/R大鼠心肌组织内TUNEL染色细胞减少,说明依托咪酯可能抑制了MI/R大鼠心肌细胞凋亡。

在心肌缺血条件下,由于管腔变窄及心脏对氧气需求的增加,可能引起心肌代谢变化,脂代谢紊乱是MI/R过程中出现的现象之一。心肌缺血可抑制脂肪酸代谢,而非酯化脂肪酸水平升高。随着有害产物的积累,脂酰辅酶A合成酶受到抑制,心肌组织内脂肪酸水平上升,脂肪酸摄取下降[18-19]。有研究显示,心肌缺血后血清非酯化脂肪酸增高,心肌组织内含量随之升高[20]。本研究结果显示,MI/R大鼠经过依托咪酯治疗后,血清TC、TG浓度降低,HDL-C浓度、血浆LPL和HL含量升高。LPL和HL为脂蛋白代谢过程中关键的两种酶,LPL活性升高可降低TG、LDL水平以预防高脂血症;LPL和HL均可催化水解微粒中的TG[21-22]。

综上所述,依托咪酯通过抑制大鼠MI/R诱导的心肌细胞过度自噬,改善心肌功能,减少心肌损伤,调节血脂代谢。这些发现为临床应用依托咪酯治疗MI/R损伤提供了实验依据。关于依托咪酯对MI/R的保护机制需在今后的工作中继续深入探讨。