云南龙陵地区产紫皮石斛和铁皮石斛中9 种功能活性物质测定及鉴别研究

◎ 林 涛，田 恒，唐艳梅，何绍鸿，陈兴连，张 娇，杜丽娟，刘宏程

（1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205；2.西南林业大学 材料与化学工程学院，云南 昆明 650224；3.云南经济管理学院 医学院，云南 昆明 650106；4.云南民族大学 民族医药学院，云南 昆明 650504）

石斛是国家卫健委公布的可用于保健食品的中草药，具有良好的生物保健功效[1-2]，在云南省有大量种植，其中龙陵产的紫皮石斛和广南的铁皮石斛因其独特的生长环境而形成特有的生物保健功能，已经成为我国的国家地理标志产品[3-5]。紫皮石斛和铁皮石斛在云南省的大部分地区都有种植，特别是在龙陵地区，大量种植紫皮石斛和铁皮石斛，但该地区产的铁皮石斛因其不属于原生态产地而在品质上难以超越紫皮石斛[6-7]。因此，如何采用快速简便的方式鉴别龙陵地区产的紫皮石斛和铁皮石斛是目前的一个首要问题。

石斛品种的鉴别离不开其中活性成分的种类和含量变化，目前对于品种的鉴别常用的仪器是高分辨质谱结合非靶向筛查技术[8-10]，前处理简单但数据分析耗时费力，且对于筛选出的特征化合物的结构确证也较为困难。根据相关文献的报道，石斛中的活性成分主要包括酚类、黄酮、糖苷、苯丙醇苷等类型，不同的品种因其基因的表达量不同而使得活性成分的代谢累积量各不相同[4,11-13]。因此，本研究以常见的紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、异槲皮素、金丝桃苷糖苷、圣草酚、原儿茶酸和香草酸等酚类、黄酮、苷类物质活性物质为研究目标，并对其在紫皮石斛和铁皮石斛中的含量进行测定，以期得到这9 种功能活性物质在龙陵地区产的紫皮石斛和铁皮石斛中的含量分布，为两种石斛的有效鉴别提供一定的基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

26个石斛样品，其中紫皮石斛和铁皮石斛各13个，都采自云南省保山市龙陵地区。

AB Triple Quad 4500 三重四极杆串联质谱仪（美国AB Sciex 公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 µm，1 mm×50 mm，美 国Waters 公司）；Multi Reax 涡旋振荡器[海道尔夫仪器设备（上海）有限公司]；KM-615C 超声波提取仪（广州科盟清洁技术有限公司）；ME204E 电子分析天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]；纯水仪（英国elga 公司）；TDL-5000bR 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

4 L 乙腈、4 L 甲醇（色谱纯，德国merck 公司）；乙酸铵（色谱纯，北京迪科马科技有限公司）；甲酸（色谱纯，北京迪科马科技有限公司）；氨水（色谱纯，美国Fisher 公司）；紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、金丝桃苷、圣草酚、原儿茶酸（纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司）；异槲皮素（纯度≥99%，成都德思特生物技术有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别将紫丁香苷、柚皮素、柚皮苷、芹菜素、金丝桃苷、圣草酚、原儿茶酸和异槲皮素利用甲醇溶解后稀释为1 mg·mL-1的标准溶液，每种标准品再分别吸取1 mL 用甲醇定容到10 mL 得到100 μg·mL-1的混合标准溶液，装入棕色储液瓶中于-4 ℃下保存。

1.2.2 样品前处理

准确称量1.000 0 g 石斛粉末于50 mL 离心管中，添加5.00 mL 的60%甲醇-水溶液，涡旋混匀后，冰浴下、80 Hz 超声30 min，5 000 r·min-1离心5 min，上清液过0.22 μm 微孔滤膜，待检测。

1.2.3 色谱条件

流动相A：甲醇；流动相B：0.1%氨水-水溶液；梯度洗脱条件：0～3 min，5%A →40%A，3～5 min，40%A →60%A，5～8 min，60%A →95%A，8～10 min，95%A；10.0 → 10.3 min，95%A →5%A；10.3～13.0 min，5%A；流速：200 μL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：1 μL。

1.2.4 质谱条件

采用ESI 离子源，正负离子同时扫描模式。气帘气流速：30 L·h-1；雾化气流速：55 L·h-1；辅助气流速：55 L·h-1；辅助加热气温度：550 ℃；喷雾电压：5 500 V；采用多反应监测模式（MRM）。9 种化合物的质谱参数见表1。

表1 9 种化合物的质谱参数表

1.2.5 数据分析

采用R 语言和Simca 软件对26 个石斛样品中的9 种活性成分进行PCA 和VIP 的分析，筛选差异较大的活性成分，并进行箱装图的绘制。

2 结果与分析

2.1 流动相条件的优化

本研究中所测定的9 种活性化合物中只有紫丁香苷是采用正离子模式，其余8 种都是采用负离子模式。为了得到较优的离子化效率，通常在负离子模式下，流动相中加入氨水以提高化合物的响应值。因此，本研究比较了0.1%氨水和不加氨水对于化合物的响应情况。结果表明，氨水的加入能够有效地提高8 种负离子模式化合物的响应值，且对于正离子模式下紫丁香苷的电离没有明显的抑制作用。为保证大部分化合物的响应情况，本研究选择在流动相中加入0.1%氨水以提高负离子模式下化合物的响应值。9种活性化合物的色谱图如图1所示。

2.2 线性范围、检出限和定量限

分别将9 种活性化合物标准溶液配制成不同梯度的溶液（表2），通过峰面积对标准浓度进行线性回归分析；采用石斛基质，添加9 种活性化合物的标准溶液，以10 倍信噪比确定方法的定量限。如表2 所示，9 种活性化合物在0.001～10.000 μg·mL-1浓度的线性相关系数较好（r2＞0.990 0），定量限为0.025～0.250 mg·kg-1，该方法的仪器检测灵敏度较高。

表2 9 种活性化合物的线性范围、相关系数（r2）、检出限和定量限结果表

2.3 回收率和精密度

本试验中以石斛作为试验对象，分别以1 倍、5 倍和10 倍定量限作为添加浓度进行回收率与精密度试验。由表3 可知，9 种活性化合物的平均回收率为70.4%～79.2%，相对标准偏差为4.27%～7.48%。

表3 9 种活性化合物的回收率和相对标准偏差结果表

2.4 紫皮石斛和铁皮石斛中9 种活性化合物含量

采用以上方法对26 个紫皮石斛和铁皮石斛样品进行9 种活性化合物含量的测定，结果如表4 所示。

表4 9 种活性化合物在紫皮石斛和铁皮石斛中的含量分布表 单位：mg·kg-1

2.5 紫皮石斛和铁皮石斛功能活性物质含量分析

试验对9 种活性化合物的含量进行PCA 分析。由图2 可知，产自云南省龙陵地区的紫皮石斛和铁皮石斛能够被有效鉴别，说明采用特征活性成分结合化学计量学的方法能够对紫皮石斛和铁皮石斛进行有效鉴别，即使是生长于相同的产地环境中，由于其中的特征活性成分存在较大的差异，也能够明显区别开。

图2 紫皮石斛和铁皮石斛的PCA 图

图3VIP 分析表明，柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷活性化合物的VIP 值都＞1，表明其在紫皮石斛和铁皮石斛的鉴别中起到了关键的作用，即为特征活性化合物。通过对该5 个特征活性化合物进行小提琴图分析（图4）可知，柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷等特征活性化合物在两种石斛中的含量差异较大（P＜0.01），特别是柚皮苷在紫皮石斛中有检出，但在铁皮石斛中未检出，可以作为鉴别紫皮石斛和铁皮石斛的关键特征指标。柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌、改善糖和脂质代谢等活性[19-21]。根据本试验结果，铁皮石斛中未检测出柚皮苷含量，但在紫皮石斛中检测出柚皮苷，这也是紫皮石斛保健功效和铁皮石斛不同的原因，该研究结果可为紫皮石斛保健食品的开发提供新思路。

图3 紫皮石斛和铁皮石斛中特征活性化合物的VIP 图

图4 紫皮石斛和铁皮石斛中特征活性化合物含量的小提琴图

3 结论

本研究利用超声冰浴辅助提取和超高效液相色谱-串联质谱建立了紫皮石斛和铁皮石斛中常见的9种活性化合物的测定方法。利用MRM 监测正负离子同时扫描模式、外标法定量，方法快速简便且灵敏度高，适合石斛中9 种活性化合物的快速测定。对采自云南省龙陵地区的紫皮石斛和铁皮石斛进行9 种活性化合物的测定并进行PCA 分析，结果表明产自相同地区的紫皮石斛和铁皮石斛能够被有效鉴别，说明采用特征活性成分结合化学计量学的方法能够对于紫皮石斛和铁皮石斛进行有效鉴别。柚皮苷、芹菜素、圣草酚、香草酸和紫丁香苷等特征活性化合物的VIP 值都＞1，其在紫皮石斛和铁皮石斛中的含量差异较大（P＜0.01），特别是在紫皮石斛中检出有柚皮苷，但在铁皮石斛中未检出该成分，可以作为鉴别紫皮石斛和铁皮石斛的关键特征指标。