山西酸枣嫩叶醇提物清除DPPH自由基及对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

张琰,李越

(1.山西药科职业学院,山西 太原 030012;2.山西省检验检测中心,山西 太原 030012)

酸枣是多年生落叶灌木植物,原产于中国,分布于湖北、四川、河南、河北、山东、山西、辽宁等地,是我国北方较为常见的一种野生经济果树资源[1-4]。酸枣叶为鼠李科枣属植物酸枣的干燥叶子。酸枣叶野生生物资源非常丰富,具有抗氧化、改善睡眠等许多保健保养功能,它是极具开发潜能的药用植物资源[5]。经研究发现,酸枣叶中含有多种成分且含量丰富,如皂苷[6]、黄酮[7]、氨基酸[8]、核苷类[9]、微量元素[10]等营养成分。由于酸枣叶有丰富的营养成分及较大的药用价值,近年来对酸枣叶的研究也较多,于庆利[11]研究了一种酸枣叶茶的加工生产方法。车勇等[12]对酸枣叶化学成分进行了研究,研究表明具有黄酮类成分和五环三萜类成分。白莉等采用紫外可见分光光度法,测定了山西九个不同地区的酸枣叶中总黄酮的含量,试验结果表明酸枣叶中总黄酮含量达到了8.04%[7]。张倩倩等研究发现酸枣叶中黄酮类成分含量高于酸枣仁,酸枣叶可能具有更强的抗氧化作用[13]。张强等[14]研究了南酸枣叶的抗氧化活性,结果表明南酸枣叶多糖对DPPH清除率的IC50值为0.57 mg/mL,其值弱于VC,期望为天然抗氧剂的开发提供数据依据。朱广龙[15]研究发现酸枣叶与许多植物富含叶蛋白相似,其富含可溶性蛋白9.99 mg/g。庄福金等[16]研究表明了山东崂山酸枣芽茶与酸枣叶对小鼠睡眠均具有明显的改善作用。Bai等[17]研究发现酸枣叶中黄酮类成分可能是保护肝脏的有效成分。本试验对山西酸枣嫩叶提取物清除DPPH自由基及对α-葡萄糖苷酶抑制作用进行研究,旨在为山西酸枣嫩叶抗氧化活性的研究提供试验依据,也在初步探索提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,为开发天然新型降糖药物奠定试验基础。

1 仪器与材料

1.1 材料

山西酸枣嫩叶于2022年5月份采自山西省太谷县酸枣种植基地。

1.2 试剂

1,1二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)(日本东京化成工业株式会社);乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亚砜(DMSO)、均为国产分析纯。α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖、PNPG(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、碳酸钠溶液、PBS缓冲液、麦芽糖。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计U-2900(日本Hitachi)、旋转式蒸发仪(RE2000B,上海亚荣生化仪器厂)、电子分析天平(FA2004,上海衡平仪器仪表厂)、KQ-500DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、SHB-B95型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、HWS-28电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)、96微孔板、Infinite M200 Pro多功能酶标仪 (Tecan公司)。

2 试验方法

2.1 山西酸枣嫩叶醇提物清除DPPH自由基的方法

2.1.1 山西酸枣嫩叶提取方法

取干燥的酸枣嫩叶100 g,研细碎,放置于圆底烧瓶中,加入80%乙醇溶液1 000 mL,加热回流煮沸3.5 h,抽滤,滤液保存备用。滤渣同法再抽提两次,合并滤液,真空蒸发至干燥,得浸膏。

2.1.2 醇提物各组分的制备

将浸膏溶于100 mL蒸馏水中,用超声波微加热助其溶解。将100 mL乙醇提取液倒入分液漏斗中,加入相等体积的石油醚,进行充分振荡,然后放至分层,将石油醚层分离出来,乙醇提取液继续用石油醚萃取至石油醚颜色清淡为止。随后合并石油醚层萃取液,减压蒸馏至干,得到石油醚萃取的浸膏。加100 mL蒸馏水,即得到相当于原药材1 g/mL的石油醚层萃取物水溶液。

继续将石油醚萃取后的提取液加入100 mL乙酸乙酯,同上萃取方法,得到乙酸乙酯萃取的浸膏。加100 mL蒸馏水,即得到相当于原药材1 g/mL的乙酸乙酯层萃取物水溶液。将乙酸乙酯萃取后的提取液中,加入100 mL正丁醇,同上萃取方法,得正丁醇萃取的浸膏。加100 mL蒸馏水,即得到相当于原药材1 g/mL的正丁醇层萃取物水溶液。将萃取完的水层,加入蒸馏水至100 mL,得到相当于原药材1 g/mL的水层提取物水溶液。各试剂稀释成适当倍数进行自由基清除率的实验。

2.1.3 DPPH法清除自由基的原理

DPPH是一种自由基,性质很稳定,其以氮原子为中心。并在515 nm波长处有一个很强的吸收峰。当DPPH溶液中加入抗氧化剂时,DPPH会和抗氧化剂相结合,DPPH溶液颜色变成浅色,在515 nm处的吸光度也变小,故此种方法用来评价抗氧化剂的清除自由基能力。吸光度如果越小,那么清除率则越大,抗氧化能力则越强[18]。

2.1.4 DPPH标准曲线的制作

用分析天平准确称取2.5 mg DPPH,用甲醇定容至100 mL,配置成质量浓度为2.5×10-2mg/mL的标准溶液,置于冰箱中备用(现用现配)。然后分别取浓度梯度为0,2,4,6,8,10 mL标准溶液,用甲醇定容至10 mL,最终质量浓度分别为0,5,10,15,20,25 μg/mL。测定上述标准溶液在波长515 nm处的吸光度,制作标准曲线(见图1)[18]。由图1得到标准曲线的线性方程Y=0.022 7x+0.051 3,R2=0.995 9,此标准曲线显示良好的线性。

图1 DPPH浓度-吸光度标准曲线

2.1.5 测定方法和清除率的计算

对DPPH自由基清除方法的测定参阅Brand-William(1995)[19]。取以上不同萃取物组分水溶液各20,40,60,80,100 μL,量取质量浓度为2.5×10-2mg/mL的DPPH溶液至4 mL,两者立即混匀。放置比色皿里面,在波长515 nm处进行吸光度的测定,直到显示的读数稳定为止。测定值代入以下公式计算出自由基清除率即为:

自由基清除率=(1-A1/A0)×100%

(1)

公式中A0为未加试样的DPPH在波长515 nm处的吸光度,A1为抗氧化性物质与DPPH反应后在515 nm波长处的吸光度。

2.1.6 IC50的计算

IC50表示清除50%DPPH自由基时所需要的抗氧化剂浓度。根据山西酸枣叶醇提物不同浓度的各组分与DPPH自由基清除率,制作关系曲线图,然后进行线性回归分析,并得到线性回归方程。最后根据线性回归方程,计算出清除50%DPPH时各组分的浓度即IC50,IC50值越小,清除自由基能力即抗氧化能力越强。

2.2 山西酸枣嫩叶醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

2.2.1 对α-葡萄糖苷酶活性抑制率的试验

α-葡萄糖苷酶可以水解PNPG生成PNP(对硝基苯酚),在碱性条件下PNP于波长405 nm处有最大吸收值,再用酶标仪测定其吸光度,可以检测加入的待测样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

酸枣嫩叶醇提物对α-葡萄糖苷酶活性抑制试验方法参照王贺[20]研究方法、结合96微孔板法[21],以PNPG为底物的酶-抑制剂筛选模型稍作改动,测定山西酸枣嫩叶醇提物各组分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。分别设置了背景组、空白组、实验组,其中实验组含有待测样品与阿卡波糖对照组,每组6孔。为了使试验结果更加可靠,对各组浓度进行调整使其抑制率曲线均通过50%。乙酸乙酯萃取物、阿卡波糖质量浓度梯度均为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/mL;正丁醇萃取物、水层萃取物质量浓度梯度均为0.6,0.8 ,1.0 ,1.2 ,1.4,1.6 mg/mL,石油醚萃取物浓度梯度为0.8,1.0 ,1.2 ,1.4,1.6,1.8 mg/mL。在96孔微孔板上,按照表1准确移取0.01 mol/L PBS缓冲液(pH值6.8)112 μL,以及一定浓度梯度待测样品8 μL,0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液20 μL,然后轻微振荡混匀。于37.0 ℃恒温放置10 min,再加入浓度为1.0 mmol/L PNPG底物溶液20 μL,在恒温37.0 ℃下反应20 min,最后加入浓度为0.2 mol/L碳酸钠溶液80 μL进行终止反应。在波长405 nm处测定吸光度值,用阿卡波糖做阳性对照,每个处理组各重复测试三次,取各组吸光度平均值代入公式计算α-葡萄糖苷酶活性抑制率。其公式如下:

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制试验反应体系 单位:μL

α-葡萄糖苷酶抑制率=[1-(A样-A样空)/(A阴-A空)]×100%

(2)

其中不加样品的阴性对照组为A阴,不加样品、酶的空白对照组为A空,同时加了样品与酶的为A样,以PBS(磷酸盐)缓冲液代替α-葡萄糖苷酶溶液的样品空白组为A样空,表1为α-葡萄糖苷酶活性抑制试验反应体系。

2.2.2 乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型的研究

参考Lee等[22]的方法,稍作改动。底物为麦芽糖,且其浓度递增梯度为0.125,0.25,0.5,1,2 mol/L,加入不同质量浓度的乙酸乙酯萃取物,其浓度梯度为600,300,150 mg/mL,然后分别测定在15 min时的吸光度。以横坐标为底物浓度的倒数1/[s],纵坐标为反应速率的倒数1/v进行作图,即双倒数Lineweaver-Burk作图法,确定乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制反应的类型。每个浓度做三个平行试验。

2.3 数据处理

采用Microsoft Excel软件进行数据统计与分析,所有试验均重复进行三次,结果以平均值±标准误差表示。

3 试验结果与分析

3.1 山西酸枣嫩叶醇提物清除DPPH自由基的试验结果与分析

原药材浓度计算公式为:

原药材质量浓度=加样体积×1/反应体系总体积×稀释倍数

(3)

如图2～5各个组分的线性回归方程分别为:

图2 山西酸枣嫩叶石油醚萃取物清除DPPH自由基的比率

图3 山西酸枣嫩叶萃后水层萃取物清除DPPH自由基的比率

图4 山西酸枣嫩叶正丁醇萃取物清除DPPH自由基的比率

图5 山西酸枣嫩叶乙酸乙酯层萃取物清除DPPH自由基的比率

石油醚层萃取物:Y=0.873 1X+1.653 3,IC50=55.37 mg/mL;

萃后水层萃取物:Y=15.201X-2.598 7,IC50=3.46 mg/mL;

正丁醇层萃取物:Y=17.183X-3.846,IC50=3.13 mg/mL;

乙酸乙酯层萃取物:Y=65.59X+2.356,IC50=0.73 mg/mL。

从试验结果可以明显看出,山西酸枣叶醇提物的各组分都具有对DPPH自由基的清除能力,并且随着浓度的梯度增加,其清除DPPH自由基的能力也不断增强,呈现出显著的剂量和效应关系。醇提物各组分清除DPPH自由基能力的强弱顺序是乙酸乙酯层>正丁醇层> 萃后水层>石油醚层,其IC50分别为0.73,3.13,3.46,55.37 mg/mL。实验结果显示山西酸枣叶醇提物清除DPPH自由基的成分主要存在于乙酸乙酯层当中,其清除能力强。其次在正丁醇和水层也存在有清除DPPH自由基的成分,其清除能力较弱。最后是在石油醚层中也存在清除DPPH自由基的成分,但能力最弱。而且正丁醇层与水层中清除DPPH自由基的成分其清除能力基本相当。

3.2 山西酸枣嫩叶醇提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的试验结果与分析

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一种通过减缓多糖的分解来降低血糖在餐后过高的口服降糖药物,其作用原理是在多糖消化的最后一个步骤来抑制双糖分解成单糖。山西酸枣嫩叶醇提物各组分在不同梯度浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性如图6所示。

由图6分析可知,山西酸枣嫩叶醇提物各组分对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。在试验浓度范围内,随着浓度升高,抑制效果增强,表现出明显的剂量依赖关系。阿卡波糖的抑制率最强,然后依次是乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水层萃取物、石油醚萃取物。

由图7可知,以IC50即抑制50%酶活性所需的抑制剂浓度作为评价标准,山西酸枣嫩叶醇提物各组分的半抑制率表现为阿卡波糖阳性对照(0.256±0.02)mg/mL>乙酸乙酯萃取物(0.385±0.02)mg/mL>正丁醇萃取物(0.542±0.03)mg/mL>水层萃取物(0.766±0.036)mg/mL>石油醚萃取物(1.178±0.042)mg/mL。其中IC50越小,对α-葡萄糖苷酶抑制作用越强。从结果看出,各组分抑制活性均差异显著,其中乙酸乙酯萃取物的抑制作用最强,但比阿卡波糖的抑制作用稍弱。

图7 山西酸枣嫩叶醇提物各组分的IC50

3.3 乙酸乙酯萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的类型分析

由酶浓度-反应初速率图8得到两条近似通过原点的直线,因而可以得出乙酸乙酯提取物对α-葡萄糖苷酶抑制类型是可逆性抑制。由于不加乙酸乙酯萃取物的直线斜率大于加乙酸乙酯萃取物的直线斜率,究其原理是抑制剂与酶和酶底物复合物通过非共价键进行的可逆性结合。

图8 山西酸枣嫩叶乙酸乙酯萃取物的Lineweaver-Burk双倒数曲线

4 结论

本试验发现山西酸枣嫩叶醇提物用三种不同的有机溶剂萃取之后,乙酸乙酯相对DPPH的清除能力较强。应用α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选模型,对山西酸枣嫩叶醇提物各组分在不同梯度浓度下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性进行试验,结果发现乙酸乙酯萃取物的抑制活性最高。这些试验结果为后续进一步研究山西酸枣嫩叶的抗氧化性和降糖作用奠定了初步基础,也为酸枣嫩叶的合理有效利用探索了一些路径。